肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）中具有多种免疫抑制特性，以限制 CD8 + T 抗肿瘤活性。近年研究发现代谢调控也参与免疫抑制微环境的形成，尤其是细胞代谢调节已被证明对 T 细胞分化和效应功能至关重要，TME 的代谢调节在 CD8 +T 细胞抑制和肿瘤免疫逃逸中起着至关重要的作用。

胆固醇代谢作为代谢调节的重要组成，对免疫细胞功能发挥及其在肿瘤微环境中的异常调控是当前免疫代谢和肿瘤免疫研究领域的热门研究问题。胆固醇代谢调控对 CD8 + T 细胞活化、克隆增殖和效应功能有至关重要的作用，尤其是影响着 CD8 + T 细胞的抗肿瘤功效。然而，TME 调控 CD8 + T 细胞胆固醇代谢的机制及其对肿瘤免疫逃逸的影响程度仍不清晰。

近日南方医科大学杨巍团队在 Protein Cell 杂志上发表了题为「Potentiating CD8 + T cell antitumor activity by inhibiting PCSK9 to promote LDLR-mediated TCR recycling and signaling」的文章，向我们阐述了胆固醇代谢如何调节 TME 中 CD8 + T 细胞的功能 [1]。

   

使用肿瘤细胞侵染小鼠 CD8 + T 细胞，系统评估了 CD8 + T 细胞的胆固醇代谢机制，通过对比低密度脂蛋白受体 LDLR（low-density lipoprotein receptor）缺乏、外源添加胆固醇等不同处理下细胞结果，显示LDLR 能够调节 CD8 + T 细胞的免疫应答和抗肿瘤活性，而这种调节机制可能和低密度脂蛋白（LDL）或胆固醇无关。通过对临床肿瘤样本并结合小鼠肿瘤模型样本检测，发现肿瘤微环境从转录水平和蛋白水平上抑制 LDLR 的表达，导致肿瘤浸润 CD8 + T 细胞胆固醇水平降低。

CRISPR/Cas9 技术敲除小鼠直肠癌细胞系和黑色素瘤细胞系中 PCSK9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，前蛋白转运酶枯草溶菌素 9）基因的表达，探究 PCSK9 作为 LDLR 调节剂与 T 细胞抗肿瘤活性的关系，结果显示肿瘤细胞来源的 PCSK9 主要作用于 CD8 + T 细胞上的 LDLR 受体，参与肿瘤免疫逃逸。PCSK9 是 LDLR 的重要负调控蛋白，可与细胞质膜上的 LDLR 结合并共同转运至溶酶体，促进 LDLR 的降解而使得 LDLR 无法循环至细胞质膜上重新再利用 [2]。

该项研究发现肿瘤微环境可以通过胆固醇代谢中的核心调控因子 PCSK9 抑制 CD8 + T 细胞中低密度脂蛋白受体 LDLR 的表达，从而抑制 CD8 + T 细胞的抗肿瘤活性。肿瘤细胞的 PCSK9 蛋白是肿瘤微环境中 CD8 + T 细胞免疫抑制的关键因素，靶向此途径在肿瘤细胞免疫治疗中具有巨大的潜力。

 

图 1. PCSK9 -LDLR 调控 TCR 活化信号参与 CD8 + T 细胞肿瘤免疫应答

 

Sony 全光谱流式细胞仪在研究中的应用

在本文研究中，探究 LDLR 在 T 细胞中功能及调控方式、PCSK9 抑制 CD8 +T 细胞活性时，作者分析了多种不同标记方案（CD3, CD8, CD44, CD45, IFNγ, NGZB， TNFα, p-ZAP70 /Syk, p-BTK/ITK, p-Akt, p-Erk），需要快速、高效、精准地分析大量来自于细胞系和组织的多色样本。

在构建了相应的细胞系模型以及荷瘤小鼠的 CTL 刺激模型后，使用流式分选技术将目标细胞分离收集起来，随后使用配备有高通量自动上样装置的 SONY SA3800 全光谱流式细胞仪检测多色 CTL 样本，用于检测 CD8 +T 细胞活化、增殖、效应细胞因子的表达，以及 LDL 的摄取和 LDLR 表达变化水平。SA3800 独特的光谱拆分解析技术，使得多色研究更为简单快速，帮助研究者获得更真实、客观的多色数据。同时配合强大的自发荧光鉴定扣减功能，实现了组织样本的精确检测，保留了流式数据的真实性、可靠性、准确性。

 

图 2. LDLR 缺乏可抑制 CD8 + T 细胞抗肿瘤活性

 

高通量全光谱分析仪 SA3800

 

• 无需补偿，光谱拆分全部由算法完成

  消除传统补偿引入的主观偏差，结果更可靠

• 每种染料仅需做一次单染管，光谱信息可被存储及调用

  实验流程大大简化，节省时间，节约试剂

• 区分高度重叠的荧光光谱

  流式实验配色更加灵活易用

• 识别并解析细胞的自发荧光

  消除非特异信号干扰，细胞类型复杂的样本检测结果

 

Reference：

1.Yuan, J., Cai, T., Zheng, X. et al. Potentiating CD8 + T cell antitumor activity by inhibiting PCSK9 to promote LDLR-mediated TCR recycling and signaling. Protein Cell (2021).

2.Poirier, S. et al. The proprotein convertase PCSK9 induces the degradation of low density lipoprotein receptor (LDLR) and its closest family members VLDLR and ApoER2. J Biol Chem 283, 2363 - 2372, doi:10.1074 /jbc.M708098200 (2008).