测序技术促进单细胞转录组、基因组的研究快速发展，但单细胞染色质可及性测序技术在实验方法和数据分析上仍然存在挑战。近日发表在 Genome Biology 杂志上的「APEC: an accesson-based method for single-cell chromatin accessibility analysis」研究，开发了一种新型的单细胞染色质可及性测序技术ftATAC-seq（fluorescent tagmentation- and FACS-sorting-based scATAC-seq）和数据分析算法 APEC（accessibility pattern-based epigenomic clustering）。该研究由中国科学技术大学生命科学与医学部、中科院天然免疫和慢性疾病重点实验室瞿昆教授团队完成。

瞿昆教授团队开发的 ftATAC-seq 测序技术是一种基于流式分选，并利用荧光标记转座酶检测单细胞染色质可及性测序方法。该团队借助了 Sony SH800S 流式细胞分选仪将标记了荧光转座体的单细胞索引分选到 384 孔板进行后续的测序分析，Sony SH800S 高效率的单细胞分选功能以及索引分选功能使得 ftATAC-seq 技术能够结合细胞蛋白组信息，富集表达特异表面分子的细胞群体，同时可以利用荧光染料标记转座酶的插入量，从而实现高效地筛选高质量的单细胞文库（Fig.1）。

 

小鼠胸腺细胞的 ftATAC-seq 方法

在 Sangon Biotech 合成 Alexa Fluor 488 标记寡核苷酸衔接子：

1. Tn5ME，5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT- 3'；

2. AF488 -R1，5′-AF488 -TCGTCGGCAGCGCGAGAGGTGTATAAGAGACAG- 3′；

3. AF488 -R2，5'-AF488 -GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG- 3'；

4. 然后将 50μM AF488 -R1 / Tn5ME 和 AF488 -R2 / Tn5ME 分别在 95°C 的 TE 缓冲液中变性 5 分钟，接着以 0.1℃/s 的速度冷却至 22℃；

5. 根据操作手册，将 AF488 标记的衔接子组装到 Robust Tn5 转座酶上以形成荧光转座体。

流式分选：

1. 将 6 - 8 周龄雄性小鼠的胸腺组织分离，加入 1 mL RPMI- 1640 轻轻研磨；

2. 单细胞悬液中的胸腺细胞通过 40μm 尼龙筛网后进行计数；

3. 1×10^6 胸腺细胞用 PerCP-Cy5.5 -anti-CD45, PE-anti-CD8a 和 APC-Cy7 -anti-CD4 抗体染色，然后在 1×PBS 配置的 1% 甲醛中室温下孵育 5 分钟；

4. 用 1×PBS 洗涤两次后，再次进行细胞计数；

5. 将 1×10^5 个固定细胞重悬于 40μL 1×TD 缓冲液（5 mM Tris-HCl，pH 8.0，5 mM MgCl 2，以及 10%DMF），其中包含 0.1%NP- 40；

6. 添加 10μL 荧光转座体并轻轻混合，荧光标记在 55°C 下进行 30 分钟，然后通过直接加入 200μL100 mM EDTA 终止混合物反应；

7. 用 Sony SH800S 分选仪检测细胞，并将 CD45 + / AF488 -Tn5 hi 群体的单个细胞索引分选到 384 孔板的每个孔中；

8. 在分选前，用于获取分选细胞的 384 孔板装有 2μL 释放缓冲液（50 mM EDTA，0.02%SDS），分选后，将孔中的细胞温育 1 分钟；

9. 未经处理的板立刻保存在- 80°C。

 

APEC 揭示胸腺单细胞调控的异质性

Fig. 1

APEC 根据小鼠胸腺细胞的 scATAC-seq 数据准确识别出细胞亚型。a. 基于 scATAC-seq 的荧光标记和流式分选流程。b. 对双阴性（DN）、双阳性（DP），CD4 +单阳性（CD4SP）和 CD8 +单阳性（CD8SP）细胞进行索引分选。c. 基于 accesson(访问子) 矩阵的胸腺细胞单细胞 ftATAC-seq 数据的 tSNE 图，其中细胞由分选索引标记。d. 纵轴表示细胞-细胞相关矩阵的分级聚类，每个单元格均按照索引分选着色。e. 基于 accesson 的 Louvain 方法将胸腺细胞聚类到 11 个亚型。

 

T 细胞在适应性免疫中起着至关重要的作用。根据表面标记 CD4 和 CD8 的表达，T 细胞在胸腺中的发育可以分为三个主要阶段，即 CD4 CD8 双阴性（DN）， CD4 CD8 双阳性（DP）和 CD4 或 CD8 单阳性（分别为 CD4SP 或 CD8SP）阶段。但是，由于技术限制，人们在单细胞水平对胸腺细胞发育全基因组的了解仍然不清楚。通常，胸腺中超过 80% 的 T 细胞停留在 DP 阶段，而 DN 细胞仅占 3% 左右。

为了消除上述细胞群体间比例差异较大带来的影响，该团队开发了基于荧光标记和 FACS 分选的 scATAC-seq 方法（ftATAC-seq），通过索引分选来操控靶细胞数量（ Fig. 1a）。在每个细胞中，通过对 Tn5 转座子进行荧光标记，根据标记效率，可以轻松地圈出 ATAC 低信号的细胞群体 （Fig. 1b, Fig. 2a）。使用 ftATAC-seq，研究者获得了经索引分选出的 352 个 DN，DP，CD4SP 和 CD8SP 单细胞和 352 个混合胸腺细胞的高质量染色质开放区数据。与已发表的大量胸腺细胞 ATAC-seq 数据进行对比分析证明 ftATAC-seq 中分选出的胸腺细胞都标记正确（Fig. 2e）。

然后，研究者在此数据集上应用了 APEC，以研究 T 细胞发育过程中染色质可及性的差异，并在单细胞水平揭示小鼠胸腺 T 细胞精细的调控组异质性。根据原始测序数据中的 130,685 个峰，APEC 聚集了 600 个访问子，并根据访问子，成功将超过 82% 索引分选的 DN，DP，CD4SP 和 CD8SP 细胞分配到正确的亚群中（Fig. 1c，d）。和预期的一样，根据细胞-细胞相关矩阵的层次聚类，将大多数随机分选和混合的胸腺细胞分为 DP 亚型，这与胸腺中细胞亚型的比例一致。APEC 将所有胸腺细胞进一步分为 11 个亚群，包括 2 个 DN，6 个 DP，1 个 CD4SP 和 2 个 CD8SP，这表明具有相同 CD4 和 CD8 表面标记的细胞之间依然存在广泛的表观遗传异质性（Fig. 1 e）。

Fig. 2

 

APEC（Fig.3）通过将所有单个细胞之间具有相同信号波动的峰合并为峰组（称为「访问子（Accesson）」），将原本非常稀疏的细胞单峰矩阵转换为细胞类型分类密度更高的细胞访问矩阵，巧妙地解决了单细胞染色质可及性数据过于稀疏的问题。

Fig. 3

 

结论

瞿昆教授团队提出的新算法 APEC 有效地改善了细胞分类，通过结合 APEC 算法和 ftATAC-seq 技术，首次在单细胞水平揭示了小鼠胸腺 T 细胞发育过程中染色质可及性的差异。

索引分选

Sony SH800S 支持单细胞的索引分选 (Index sorting) 功能，即单细胞分选模式下将细胞分选至孔板等装置时，能实现细胞的「点对点」溯源。帮助用户直观的追溯已分选细胞在所有通道的荧光强度，尤其适用于单克隆细胞建系研究，以及蛋白组和基因组多组学之间的研究。

那么在 Sony SH800S 流式分选仪上怎样进行索引分选的操作呢？这里以杂交瘤细胞为例，介绍 96 孔板单细胞索引分选构建单克隆细胞系的流程。

 

索引分选流程

1. 索引分选设置

1.1 打开「Sort Settings - Plate Sort Settings」操作界面，勾选「Add index sort information」选项

1.2 设置 A1 孔分选 100 个细胞，用作阳性对照孔；剩余孔设置各分 1 个细胞

1.3 完成设置后，点击「Index Sort Start」开始分选

2. 索引分选结果确认

2.1 观察 index sorting 信息

2.2 孔板静置半小时后放于显微镜下观察细胞入孔结果

2.3 等待 5 天后再次观察孔板内单细胞克隆生长状况

Reference:

Li B, Li Y, Li K, et al. APEC: an accesson-based method for single-cell chromatin accessibility analysis[J]. Genome Biology, 2020, 21(1): 1 - 27.

Rodriguez-Meira et al., 2019, Molecular Cell 73, 1292–1305.

Higdon, L.E., Journal of Immunological Methods, https://doi.org/ 10.1016 /j.jim.2018.12.006.