胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）属最为棘手的癌症之一，主要原因是PDAC对于化疗和免疫疗法具有极高的耐受度，包括已被证实对其他癌种表现出较好疗效的明星单抗药物，且预后效果极不理想。产生耐受性的原因主要是目前的几类药物极难对PDAC肿瘤内部产生有效的靶向作用，同时相关的肿瘤微环境（TME）具有纤维炎性基质，有助于促进肿瘤继续发生，限制药物的靶点接近性，抑制免疫系统发挥抗肿瘤活性。

 

    人类PDAC病例中高达95%患者存在KRASG12D突变，虽然目前试图靶向KRAS及其下游信号通路的药物均以失败告终，但此类药物的联合使用却在动物实验中表现出了有趣的正向抑制结果。有实验证实了使用MEK抑制剂trametinib和CDK4/6抑制剂palbociclib（T/P）抑制Ras通路下游信号，可诱导视网膜母细胞瘤蛋白（RB）介导的细胞衰老反应，进而持续抑制肿瘤细胞增殖。

    细胞衰老是一种生理性逆境反应，可使细胞终止增殖活动，协同免疫系统清除具有癌变倾向的受损细胞，是机体创伤愈合活动中的一部分。细胞衰老可由KRAS突变类的癌变信号触发，是抑制组织癌变的天然屏障。细胞衰老信号中有两个关键分子，一是RB分子，负责紧缩染色质状态阻止增殖基因的转录翻译；二是NF-κB分子，诱导表达分泌趋化因子/细胞因子和基质金属蛋白酶等调控因子改变胞外微环境，后者也常被称为衰老相关分泌表型（SASP）。SASP因子可以是促癌变的，也可以是抑制癌变的，取决于细胞及组织所处实际环境。

    鉴于T/P联合用药可显著诱导PDAC细胞系发生细胞衰老，为探究这一衰老活动是否可以影响TME，来自凯特琳癌症中心（MSKCC）的研究者分别使用KRASG12D (K)、Trp53R172H (P，约75%病例存在Trp53点突变)和Pdx1-Cre (C，Pdx1为胰腺标志物；Cre用于激活KRAS和Trp53转录)基因小鼠构建了两种KPC模型小鼠：Pdx1-Cre; LSL-KRASG12D; Trp53fl/wt (KPCflox)小鼠用于构建原发性PDAC模型；Pdx1-Cre; LSL-KRASG12D; Trp53R172H/wt (KPCmut)细胞类器官移植的小鼠用于构建双突变PDAC模型。在研究中发现出乎意料的抗癌效果，血管重塑效应和再度解封的免疫靶向杀伤能力可有效抑制小鼠PDAC肿瘤并使其发生退化。

 

T/P疗法引发的SASP反应可重塑PDAC血管系统

    在经过两周的T/P联合用药后，肿瘤细胞增殖活动明显停止，衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）明显增加。病理组学染色显示与Vehicle (DMSO)对照组相比，经过用药处理后PDAC内部出现了明显增多的血管系统，同时血管与肿瘤细胞间明显贴近；CD31+染色显著，表明血管密度增加，同时出现更多的开放管腔；肿瘤血管内出现更多α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）和血管外皮细胞标志物PDGFRβ，表明成熟血管系统的生成；此外血管内皮细胞亦被激活，上调了相关免疫调节分子的表达，如P-selectin, VCAM-1和ICAM-1（图1）。

Fig 1. Trametinib and Palbociclib Treatment Triggers Vascular Remodeling in PDAC

 

    在KPCmut PDAC类器官细胞培养过程中，实验人员收集到限定培养液并用于培养内皮细胞，结果发现这些限定培养液可明显支持内皮细胞增殖。特别是当使用3D基膜培养内皮细胞时，限定培养液有助于细胞生成更多与体内血管形状类似的管状结构。

Fig 2. SASP Factors Contribute to Vascular Remodeling in PDAC

 

    为验证SASP因子是否有助于肿瘤内血管重构， KPCmut类器官细胞转染靶向NF-κB通路p65蛋白的shRNAs，p65蛋白是SASP诱导所需的转录因子但不参与细胞的生长终止。和预测结果一样， NF-κB信号的阻断同时降低了免疫调节因子以及促血管生成因子的表达，随之相应地阻断了血管密度的提升和相应的免疫活化行为（图2）。

    VEGF是众多SASP因子中的一种，对于血管重构具有重要作用。T/P处理可显著提升肿瘤细胞的VEGF表达分泌，当使用VEGFR-2中和抗体DC101抗体阻断其与VEGF的结合后，T/P处理后的血管重塑效果出现明显下降。但VEGFR-2阻断并未抑制内皮细胞活化标志物P-selectin和VCAM-1的上调表达，反而是CCL5, CXCL1和IL-6阻断可有效形成活化抑制作用，说明了不同的SASP因子相互间协同作用，共同诱导了血管重构和内皮细胞的活化。

Fig 3. Senescence-Inducing Therapies Sensitize PDAC to Cytotoxic Chemotherapy

 

    PDAC肿瘤内部血管稀少且供血不足，使得药物无法有效递送至肿瘤内部发挥靶向杀伤作用，这是导致PDAC具有极强化疗耐受性的主要原因。为验证SASP诱导的血管重塑是否可以增强肿瘤组织的内部渗漏性，在T/P用药处理后，分别向荷瘤小鼠注射凝集素和高分子葡聚糖以及C14标记的PDAC标准化疗药物吉西他滨。与血管重塑结果一致，T/P处理组中血管内部出现显著增多的凝集素和葡聚糖沉积；放射示踪显示吉西他滨在小鼠体内也表现出了强化的肿瘤渗透作用，特别是在含有高浓度SA-β-gal+的衰老细胞和四周血管中心附近。使用DC101抑制血管重构或者敲除p65基因后上述肿瘤渗透作用明显降低，证实了血管渗漏性的增加（图3）。

    为评估吉西他滨和T/P联合用药是否可以提高疗效，分别对荷瘤小鼠进行用药处理，实验结果显示吉西他滨单独用药组仅有中度的小鼠存活率，T/P处理组肿瘤形成时间有所延长但存活率没有显著改变，而联合用药组表现出了强效的肿瘤抑制活性和显著提升的存活率。因此T/P治疗可促进肿瘤细胞衰老，并在肿瘤内部重塑血管系统，增强相关药物的毒性靶向杀伤能力。

 

SASP-衰老反应活化内皮细胞进而促进T细胞浸润肿瘤

    除去血管系统功能失调外，PDAC肿瘤组织中存在相当数量的免疫抑制性髓系细胞和Treg细胞，同时伴随着极少数量的细胞毒性T细胞，因而这类组织可称为免疫沉寂区。T/P处理组PDAC内部没有见到明显增加的活化NK细胞，而使用抗体拮抗NK细胞后， KPCmut小鼠也并未表现出显著性的存活差异。相反的是两周后，研究者观察到更多的T细胞发生肿瘤浸润，经免疫表型鉴定这些细胞属于CD8+ T细胞表型，同时其抑制性调控细胞亚群如Ly6G+中性粒细胞，Gr-1hiCD11b+ MDSC，FOXP3+ Treg和FAP+成纤维亚群细胞没有出现表达差异。在敲除p65基因后CD8+ T细胞的募集效应出现显著下降，证实了SASP诱导的血管重构对募集CD8+ T细胞浸润肿瘤组织具有重要的影响作用（图4）。

Fig 4. The SASP Promotes T Cell Infiltration via Endothelial Activation

 

    为评估CD8+ T细胞的募集效应是否与内皮细胞的活化有关，研究者使用抗体拮抗P-selectin配体PSGL-1，VCAM-1和ICAM-1。结果显示仅在阻断VCAM-1蛋白后，CD8+ T细胞浸润募集效应才会出现明显下降。VCAM-1通过与配体VLA-4结合，可调控T细胞的血管黏附和组织间浸润迁移，故而SASP诱导的血管重构，特别是VCAM-1/VLA-4迁移信息流向，增强了CD8+ T细胞的肿瘤浸润能力（图5）。

Fig 5. Therapy-Induced Senescence Leads to T Cell Activation and Exhaustion

 

    尽管T/P处理可有效募集CD8+ T细胞浸润TME并将其活化，但在PDAC内部的CD8+ T细胞并未发挥出有效的抗癌能力。对此研究者从荷瘤小鼠中提取了PADC组织，并使用Sony MA900自动化分选仪将CD8+ T细胞从复杂原代肿瘤样本中分选出来，发现这些细胞并未明显表达CD107a，而是高表达了PD-1，2B4，CTLA-4和LAG3，同时免疫细胞/内皮细胞和肿瘤细胞均显著表达了PD-L1，表明CD8+ T细胞已被TME耗竭，无法发挥抗肿瘤功能。因而在SASP衰老作用下，CD8+ T细胞尽管可以浸润肿瘤组织并被激活，但由于TME的耗竭影响，未能展现出期望的靶向杀伤能力。

 

PD-1抑制剂重塑免疫抑制环境，解封T细胞靶向抗癌活性

    基于上述实验结果，研究者猜测T/P可以重塑PDAC内部血管系统，增强T细胞浸润能力，因此与PD-1抑制剂联合用药后，或许可以解封CD8+ T细胞的靶向杀伤能力，实现可观的抗癌疗效。经过T/P/anti-PD-1联合用药后，从PDAC中分离CD8+ T细胞检测发现耗竭marker显著下调，同时CD44/CD69活化marker显著升高，此外TNF-α, INF-γ和granzyme B功能因子也有显著表达，证实了上述联合疗法可逆转PDAC中的T细胞功能抑制状态，获得有效的抗肿瘤能力（图6）。

Fig 6. T Cell Exhaustion Is Reversed by PD-1 Blockade that Triggers Anti-tumor Immunity

 

    与标准化疗方案吉他西滨相比，T/P/anti-PD-1联合用药可显著降低KPCflox小鼠和KPCmut小鼠的PDAC肿瘤大小，并显著提高实验组小鼠约5倍的存活率。在敲除p65基因，阻断VEGFR-2和VCAM-1信号传递后， T/P/anti-PD-1联合用药的抗癌疗效出现显著下降，并且这一抗肿瘤活性依赖于CD8+而非CD4+ T细胞（图7）。

Fig 7. Senescence-Associated Vascular Remodeling Potentiates Immune Checkpoint Blockade in PDAC

 

    所有实验结果表明，T/P诱导的SASP细胞衰老可显著增强T细胞对处于免疫沉寂状态的肿瘤组织内部的浸润能力，随之强化了TME对于PD-1抑制剂的阻断敏感性，提供了联合用药获得更强抗癌效果的可行性。

 

结论

1. PDAC高度纤维化的基质环境导致了肿瘤内部血管稀少，使得供血不足并形成了免疫抑制性的TME环境，阻碍了小分子药物的靶向递送能力和抗肿瘤活性的发挥，最终形成了PDAC对相关药物的治疗耐受性。

2. T/P疗法可以引发SASP细胞衰老反应，重塑PDAC肿瘤内部血管系统，增加血管密度和通透性，改变TME，提高相关药物的靶向递送能力。作为标准疗法的吉西他滨，联合T/P用药后可显著靶向呈递至肿瘤内部，发挥肿瘤细胞凋亡诱导作用。

3. SASP细胞衰老反应还可经由VCAM-1信号活化内皮细胞，促使淋巴细胞黏附血管并浸润肿瘤TME。

4. 虽然CD8+ T细胞会被TME拮抗抑制，但在使用PD-1抑制剂阻断免疫抑制状态后，仍可重新唤醒CD8+ T细胞的毒性杀伤能力，促使肿瘤发生退化。

5. 药物引起的组织重塑效应可唤醒机体的固有免疫抑制途径实现抗癌效果。对于其他癌症来说，也可能寻找到有效的靶向药物引发衰老反应重塑肿瘤表型，实现全新的治疗效果。

 

Reference:

Ruscetti et al., Senescence-Induced Vascular Remodeling Creates Therapeutic Vulnerabilities in Pancreas Cancer, Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.008

Morris, J. P., et al. (2010). KRAS, Hedgehog, Wnt and the twisted developmental biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Reviews Cancer, 10(10), 683-695. doi:10.1038/nrc2899

Sunil R. Hingorani, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell, 2005 May; 7(5): 469-83

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