中性粒细胞是外周血中数量最多的白细胞，是机体抵御病原体入侵的重要防线。其杀菌作用主要有两个途径：一是通过颗粒中含有的各种蛋白形成的防御系统，另外还可以通过形成中性粒细胞胞外捕网（neutrophil extracellular traps , NETs）达到杀伤效果。中性粒细胞细胞质中存在几种类型的颗粒结构，按组成成分可以分为嗜天青颗粒，特异性颗粒，明胶酶颗粒和分泌泡等。这些颗粒中累积了受体、蛋白酶、抗菌肽和蛋白质等等。此外，中性粒细胞被病原体、脂多糖等激活后可以形成NETs结构。NETs是中性粒细胞释放到胞外的网状纤维结构，以核内或线粒体内DNA为骨架，负载抗菌肽、水解酶等多种蛋白。这两种结构均具有很强的杀伤作用，能有效地抑制病原体。

 

通常认为，中性粒细胞寿命很短，能够快速到达损伤或感染部位，在血液循环6-10小时后，便可迅速消失不见。然而，这并不意味着它们会立即被清除，它们可以在多个器官的血管或实质中被发现，如肺部、脾脏、骨髓等。有研究发现，人类中性粒细胞可以存活4-5天时间[2]。如果中性粒细胞未及时清除或NETs过度形成，中性粒细胞的杀伤特性也会变成一柄“双刃剑”。事实上，肺很容易受到中性粒细胞介导的损伤，例如NETs可附着在肺内皮细胞上并引起其凋亡，直接导致组织损伤。

因此，抑制中性粒细胞对组织造成的毒性十分具有研究价值。下面的文章中，Jose等人[1]以蛋白组学为切入点，发现了中性粒细胞的一种“解除武装”的方式：在循环过程中通过改变自身蛋白质组，使颗粒含量减少和NETs形成能力降低，从而降低炎症反应程度。这种方式由受体CXCR2驱动并呈现生理上的周期性。

 

1.在一天当中，中性粒细胞蛋白质组会发生改变（The neutrophil proteome changes during the day.）

作者设置了两个不同时间组：夜间组和日间组。

夜间组（中性粒细胞从骨髓中释放出来）；日间组（中性粒细胞在血液中循环了一段时间）。

夜间组处理方法：在亮灯后4小时（zeitgeber time，ZT4）一次性腹腔注射AMD3100（一种CXCR4的拮抗剂，可诱导骨髓中性粒细胞的快速动员）来增加从骨髓中释放的中性粒细胞的数量。

日间组处理方法：在中性粒细胞采集前5天、3天和1天静脉注射P/E-选择素阻断抗体以增加血液循环中日间组中性粒细胞的数量。

通过对两组不同时间中性粒细胞的蛋白质组共6677种蛋白质比较发现，有171种差异化蛋白（图1A），并通过对CD74、VEGFR1等蛋白采用Sony SP6800全光谱流式分析仪进行检测证实差异性（图1B）。然后通过GO功能分析（Gene ontology analysis）发现这些差异蛋白参与免疫防御、细胞因子信号调控和血管再生（图1C）。

将中性粒细胞蛋白质组与转录组数据对比发现其相关性较差（图1D），这表明蛋白质组的变化不是由转录调控直接驱动的。综上得出第一个结论：蛋白质组的变化与中性粒细胞循环时间相关。

  

2. 循环中性粒细胞在稳态中会发生脱颗粒作用，并逐渐降低产生NETs的能力（Circulating neutrophils degranulate in the steady state. Neutrophils progressively lose NET-forming capacity.）

根据蛋白质组学数据，与日间组颗粒相比，存贮在夜间组中性粒细胞各类型颗粒中的蛋白质含量更高（图2A）。表明随着中性粒细胞体内循环，颗粒逐渐丢失。通过Sony SP6800，每4小时检测粒细胞的背向散射光信号发现，细胞颗粒度呈周期波动（图2B）。为了进一步证明背向散射光信号改变是由于脱颗粒产生的，作者接着对Ly6G+中性粒细胞的DNA和MPO（髓过氧化物酶，存贮于嗜天青颗粒中的蛋白）进行染色，通过共聚焦显微镜观察发现，MPO+颗粒的最大丰度在ZT17（夜间组），而丰度最低的时候在Z1（日间组）。表明中性粒细胞上嗜天青颗粒的确逐渐减少（图2C）。最后，与血液中的Ly6G+中性粒细胞相比，来自肺、脾和肝的Ly6G+中性粒细胞具有更低的MPO+颗粒含量（图2D）。

通过蛋白质组学数据分析我们还可以发现，与NETs相关的蛋白，例如可以促进核组蛋白降解的蛋白酶Proteases在夜间组的比例明显高于日间组。为了直观判断不同时间产生NETs能力是否有差异，我们用PMA（佛波酯，NETs的一种诱导剂）分别刺激ZT13（夜间组）和ZT5（日间组）的中性粒细胞，随后对NETs携带的MPO蛋白和Cit-H3蛋白（瓜氨酸化组蛋白H3）染色，观察可知ZT13（夜间组）比ZT5（日间组）产生更多的NETs（图3）。因此可以得到第二个结论：中性粒细胞在进入组织之前，在循环中发生稳态脱颗粒现象，NETs生成能力也逐渐降低。

图2. B：LD（light-dark cycle）从日间到夜间；DL（dark-light cycle）从夜间到日间。D：ZT1, ZT5, ZT9为日间组；ZT13, ZT17, ZT21为夜间组

  

3. 蛋白质组的变化是由CXCR2和Bmal1驱动的（Proteome changes are driven by CXCR2 and Bmal1）

中性粒细胞转录和迁移受细胞内在机制调控，生物钟核心蛋白Bmal1调节趋化因子CXCL2的表达，并通过CXCL2–CXCR2信号传导调节中性粒细胞的自主的日变化活动。因此，作者也测试了这一机制是否是导致蛋白质组的变化原因。

首先利用野生型小鼠验证CXCL2可以引起中性粒细胞的脱颗粒作用。（图4A）紧接着作者用CXCL2处理CXCR2ΔN型小鼠（中性粒细胞特异性缺失CXCR2的小鼠）ZT5（日间组）和ZT13（夜间组）的中性粒细胞，发现MPO+颗粒含量没有差异，NETs产生的数量也没有了明显的差异。同样的现象在Cxcl2−/−型小鼠中也可以发现（图4B，C）。但如果用LPS或PMA刺激CXCR2ΔN型小鼠的中性粒细胞，脱颗粒现象仍然可以发生（图4D）。

此外，在移植了DsRed+野生型和CXCL2-/-小鼠骨髓的嵌合体小鼠中，CXCL2-/-中性粒细胞的颗粒含量高于同时间点（ZT5）野生型中性粒细胞颗粒数量（图4E），这表明中性粒细胞能自分泌CXCL2以控制颗粒含量。已有研究表明，CXCL2的表达受转录因子Bmal1的调控[3]。因此，在Bmal1ΔN型小鼠（缺失编码Bmal1基因Arntl的小鼠）中我们也能得到相似的结论，Bmal1ΔN型小鼠夜间组和日间组中性粒细胞颗粒含量，NETs形成能力，相关蛋白的蛋白组学分析结果均没有显著差异。通过这些数据可以得出第三个结论：Bmal1和CXCL2–CXCR2的信号传导控制了中性粒细胞颗粒含量的变化和NETs形成能力。

  

4. 在一天当中，肺损伤的严重程度是不同的（The severity of lung injury varies during the day.）

为了验证中性粒细胞蛋白质组的日变化是否影响组织炎症反应，作者构建由LPS和抗体诱导，中性粒细胞及其NETs引起的急性肺炎症（acute lung inflammation，ALI）Balb/c鼠模型。通过MPO、DNA和Cit-H3染色证明确实产生了NETs（图5a）。

通过Ly6G染色锚定中性粒细胞，通过标记Sytox-green的 DNA的快速释放判定NETs位置（图5b），利用活体成像技术，连续追踪40分钟内中性粒细胞动力学行为（图5c），从数据中可以看出，ZT13（夜间组）NETs的释放数量远远高于ZT5（日间组）和Chloramidine（对照组，诱导ALI前1h静脉注释PAD4抑制剂，抑制Sytox-green+的释放）。在加入LPS和抗体几分钟后，夜间组NETs就开始明显增长，并在后续一段时间内一直维持在较高水平。

接着利用肺泡腔内血浆渗透引起的水肿程度评价昼夜间NETs不同浓度对于肺部损伤严重程度。通过CT结果发现，与ZT5（日间组）相比，ZT13（夜间组）小鼠的肺含水量急剧增加（图4d，e）。ZT13小鼠存活率也低于ZT5，而Chloramidine对照组可以更好的保护小鼠免于水肿和死亡。这也就意味着，ALI模型中肺损伤的严重程度与颗粒含量和NETs形成能力昼夜变化具有相关性。

  

5. 中性粒细胞蛋白质组的变化驱动肺损伤（Variations in the neutrophil proteome drive lung injury.）

为了评估中性粒细胞颗粒含量和Nets形成能力变化是否会导致肺部炎症，作者使用了两种模型鼠：Bmal1ΔN型和CXCR4ΔN型（CXCR4缺陷小鼠，CXCR4是一种CXCR2信号的负调节因子，尤其在中性粒细胞中）。流式分选Bmal1ΔN型和CXCR4ΔN型 ZT5（日间组）Ly6G+中性粒细胞；野生型ZT5和ZT13（夜间组） Ly6G+中性粒细胞。

MPO免疫荧光和电子透镜结果显示，Bmal1ΔN型 ZT5的中性粒细胞嗜天青颗粒含量高于野生型ZT5的含量，与野生型ZT13相当。相反，与野生型相比，CXCR4ΔN型ZT5的中性粒细胞一直处于显著降低的状态（图5a，b）。当经过PMA刺激后，与野生型相比，Bmal1ΔN型 ZT5的中性粒细胞形成的NETs增多，而CXCR4ΔN型显著降低（图5c）。因此可以认为颗粒含量和NETs形成能力是中性粒细胞的固有程序。

与CXCR4ΔN型相比，Bmal1ΔN型 ZT5的中性粒细胞更快更多的形成了NETs（图5d），肺水肿程度也更剧烈，小鼠存活率更低（图5e,f）。这些数据都证实了：炎症程度和中性粒细胞蛋白质组变化息息相关。

 

总结

1. 中性粒细胞存在一个固有的程序，可以降低自身杀伤能力，防止过度炎症反应或造成血管、组织的损伤。

2. 该程序通过Bmal1和CXCL2–CXCR2信号通路调控，通过降低颗粒含量和NETs形成能力达到“解除武装”的效果。

3. 这种变化还呈现出时间上的规律性，即夜间组（中性粒细胞从骨髓中释放出来）杀伤能力要高于日间组（中性粒细胞在血液中循环了一段时间）。在循环中发生的这种变化不太可能是转录调控的，因此这种免疫调节程序可能是粒细胞特有的。

4. 因此人为干预诱导中心粒细胞“解除武装”或把NETs作为新型分子药物靶点将成为一些自身免疫疾病治疗新的思路。

5. 从文中采取的实验方法中不难发现，流式既可以分析多种蛋白之间的差异性，也可以检测细胞颗粒度的改变，很好的体现了该技术参数多通量高的特点。Sony全光谱流式分析仪无需补偿调节，进一步提高了实验效率和数据客观性。

 

参考文献：

1. Jose M. Adrover, et al. Programmed ‘disarming’ of the neutrophil proteome reduces the magnitude of inflammation. Nat Immunol, 21(2):135-144, 13 Jan 2020

2. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood, DOI：10.1182/blood-2010-01-259028

3. Adrover, J. M. et al. A neutrophil timer coordinates immune defense and vascular protection. Immunity 51, 966–967 (2019).