​细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是细胞释放具有生物活性的微小囊状结构，可在细胞间进行物质传递，使其成为天然的药物递呈工具，具有成为治疗药物载体的巨大潜力。如在工程改造的干细胞产生的EV中包装小干扰RNA或短发夹RNA。与脂质体或纳米颗粒等其他药物载体相比EVs的免疫原性/细胞毒性更低，与干细胞本身相比更具安全优势。另外还有稳定性好，能穿越血脑屏障等诸多优点。

图1：个性化囊泡递送[1]

虽然纳米囊泡可从细胞培养上清获得，但其中存在一些问题。例如EVs的产量非常低，很难获取到足够用于载药研发的EVs。其次，天然EVs靶向性较差，通常需要通过工程改造使EVs携带能识别肿瘤细胞的配体。此外，由于MSC等有核细胞产生的外囊泡很小，只能运输较短的RNA，但RNA治疗药物除了化学修饰的siRNA外还包括了反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides ，ASOs）以及CRISPR–Cas9相关的向导RNA（gRNA）和mRNA等。

 

为了解决这些问题，一种理想的RNA药物载体--红细胞（RBC）进入了科学家们的视野。作为RNA药物载体，RBC有着许多突出的优势：

1. 红细胞是体内最丰富的细胞类型，可以很容易地从任何人身上获得；

2. 红细胞缺乏细胞核和线粒体DNA，红细胞外囊泡（RBCEV）不会产生任何基因水平转移的风险；

3. 红细胞外囊泡足够的“大”，可以装载比较大的mRNA和递送基因编辑工具。
 

香港城市大学史家海教授便是最早一批涉足该领域的科研工作者，发表了多篇相关论文，证明了红细胞可以改造为携带小分子、外源蛋白质的药物载体。史教授作为创始人建立的基于红细胞外囊泡的药物及基因治疗递送平台Carmine Therapeutics公司不久前与国际制药巨头武田制药达成了9亿美元的药物研发合作协议，可以看出资本市场对史教授及其团队在RBCEV相关技术研发的肯定与希冀。本文中我们将聚焦其团队将红细胞作为RNA药物载体工具的潜力挖掘。让我们从其中一篇论文出发[2]，来感受一下RBCEV的魅力吧。

01： 红细胞外囊泡的纯化和鉴定

RBCEV纯化流程：

1.全血去除血浆和白细胞；

2.钙离子载体处理红细胞使其产生大量EVs；

3.低速离心去除细胞和碎片；

4.高速离心纯化EVs。其中第二次离心加入60%蔗糖缓冲液100,000g 4℃离心16小时。

 

通过该方法每200ml血液可分离出5-10×1E13的外囊泡，其直径平均140nm，多分散性指数~0.07，Zeta电位为−11.5 mV。电镜结果显示，RBCEVs是由小的外泌体样和大的囊泡样颗粒混合而成（左上）。通过检测EVs特异性指标ALIX和TSG101和红细胞特异性指标HBA来证明没有混入其他细胞的EVs。同时可以利用RBCEVs表达STOM（红细胞膜整合蛋白）并缺乏Calnexin（内质网特异性标记物）的特性来进行佐证（右上）。有趣的是，在多次冻融循环后，RBCEVs表现得非常稳定。在1-3个冻融循环后，RBCEVs的形态、浓度和尺寸没有任何显著变化（下图）。

02： RBCEV递送反义寡核苷酸（ASOs）

想要成为RNA药物载体，首先要保证靶细胞能够高效吸收RBCEVs。将用PKH26（一种红色荧光染料）标记的RBCEVs加入GFP+ MOLM13细胞（人类急性髓细胞性白血病细胞株，通过Sony SH800分选）中孵育24h，与未处理组相比，99%的MOLM13细胞PKH26呈阳性，因此白血病细胞可以高效吸收RBCEVs。但当RBCEVs与肝素钠一同加入后，阳性比例下降了60%-70%（右图）。由此可以推断，RBCEV的摄取依赖于HSPG（硫酸乙酰肝素蛋白多糖）。

随后开始进行ASOs的装填。作者先用Alexa Fluor® 647标记的葡聚糖优化电穿孔条件，在250V电压下获得了最佳的装填效率。接着用FAM标记的阴性ASOs(FAM-NC-ASOs)进行装填。然后用不同密度的蔗糖对电穿孔后溶液进行梯度离心，得到12个组分层。EV浓度与FAM荧光强度变化趋势一致，说明装填成功。组分1为未结合的FAM-ASOs，其FAM荧光强度大于组分6中EVs的FAM荧光强度，说明ASOs过量，保证了充分装填（左上）。为了检测RBCEVs内RNA的稳定性，将电穿孔后装填了FAM-ASOs的RBCEV（右上红线，E-FAM）、未电穿孔的RBVEVs与FAM-NC-ASOs缓和液（右上蓝线，UE-FAM）置于含50%FBS的OptiMEM中孵育72小时，可以看出RBCEVs保护了ASOs不被胞外核酸酶降解。此外，与其他商品化RNA转染试剂相比，RBCEVs具有更高的效率（左下）和更低的毒性（右下）。

 

03：利用装载125b-ASO的RBCEV抑制miR-125b

miR-125b是白血病细胞、前列腺癌和乳腺癌中一种已证实的致癌microRNA，通过调节与细胞增殖的靶基因如p52、BAK1等表达来改变细胞增殖与凋亡能力。目前尚无针对miR-125b的有效治疗方法。作者将anti-miR-125b ASOs通过电穿孔导入RBCEV，向MOLM13中加入不同浓度的EVs，可以看出随之EVs浓度增高，MOLM13细胞中miR-125b的水平被抑制80-95%（左上）。受miR-125b抑制的BAK1蛋白表达量随之增加（右上）。培养四天后MOLM13增殖水平明显下降（左下），在人乳腺癌MCF10CA1a中可以得到类似的结果（右下）。

除体外实验外，作者还构建了小鼠模型验证了RBCEV在体内的潜在效用。作者先将荧光素酶标记的CA1a细胞植入雌性裸鼠左侧皮下，随后每三天注射ASOs或装载ASOs的RBCEV。治疗30-42天后，装载了125b-ASO的RBCEV显著抑制了乳腺肿瘤生长，与各对照组相比，肿瘤发光强度明显降低，肿瘤体积明显变小。治疗过程中，与对照组相比，实验组小鼠体重没有变化，说明RBCEV不会产生毒性作用。另外，对各组小鼠肺部切片进行HE染色，实验组中肿瘤在肺部迁移程度最低。

04：RBCEV递送Cas9 mRNA和gRNA

为了验证RBCEVs递送mRNA的可行性，作者将HA标记的Cas9 mRNA（4521个核苷酸）通过电穿孔导入RBCEVs中，并用它们治疗MOLM13细胞。培养48小时后，Cas9E-EVs实验组MOLM13细胞中可以检测到50%左右的HA阳性细胞。随后，作者设计了一个靶向mir-125b-2基因座的gRNA，用装载有Cas9 mRNA和125b gRNA的RBCEVs处理MOLM13细胞，2天后，miR-125b表达减少了约98%，BAK1上调了大约三倍。测序数据证实，在每个突变体克隆中，除了原间隔区相邻基序（PAM）序列外，还有一个3-8个核苷酸的切割位点，在该位点插入或缺失的不同片段破坏了成熟的miR-125。这也是miR-125b被高效抑制的原因之一。上述结果证明，RBCEVs不仅能够递送短链的RNA，而且能够有效递送长链的mRNA。

 

总之，红细胞外囊泡稳定无突变，其基因有效载荷能力与有核细胞EVs相比显著提高（超过11KB），并可进行表面修饰增强靶向性，展现出了巨大的RNA药物载体潜力，因此可作为多种RNA药物载体工具，为癌症治疗提供新思路。

参考文献：

1. Ingato, D et al. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release

DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.09.016

2. Usman WM et al. Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellular vesicles. Nature Com. DOI: 10.1038/s41467-018-04791-8