​2020年诺贝尔化学奖“花落”法国生物化学家埃玛纽埃尔·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）和美国化学家珍妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna），以表彰这两位女性科学家“发现了基因编辑技术中最有力的工具之一：“CRISPR /cas9基因剪刀。”

 

Cas9 in vivo: Bacterial Adaptive Immunity

Emmanuelle Charpentier其主要的贡献在于发现Cas9蛋白的活性仰赖tracrRNA。Jennifer A. Doudna与Emmanuelle Charpentier博士共同发现Cas9的切割作用和crRNA的定位作用，并将crRNA与tracrRNA可以融合成单链引导RNA（sgRNA）。利用这些技术，研究人员可以极其精确地改变动物、植物和微生物的DNA。这项技术对生命科学产生了革命性的影响，正在为新的癌症疗法做出贡献，并可能使治愈遗传疾病的梦想成为现实。

 

在基因编辑相关研究中，也少不了流式细胞术的身影。从监测转染效率、富集特定细胞亚群，到确认编辑效果和进行下游分析等方面都可以发现流式细胞术发挥着重要的作用。因此，一台高效稳定能够兼顾分析分选的流式细胞仪，成为了顺利完成工作的的重要保障。两位诺奖获得者Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna不约而同地选择了Sony全自动流式细胞分选仪SH800助力各自科学研究。下面通过两位诺奖获得者各自的一篇文章，看看Sony全自动流式细胞分选仪SH800在基因编辑工作中都扮演着那些角色吧。

 

Jennifer A. Doudna

詹妮弗·杜德纳

第一篇是Jennifer A. Doudna等人 2019年发表在Cell上的一篇文章“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification”[1]。使用CRISPR基因编辑工具，研究人员原则上可以在他们想要的任何基因组中进行切割。但CRISPR /cas9也不是无所不能的，例如由于Cas9一直处于活跃状态（always-on）常出现“脱靶”（off-target genome editing），研究者缺乏对其活性控制，因此希望可以通过内源性或外源性信号控制其活性。Jennifer A. Doudna等人通过循环排列（circular permutation，CP）的方式，围绕dCas9（enzymatically deactivated Cas9, 酶失活Cas9）构建出一系列（总共661个）Cas9新型变体Cas9-CP，随后通过Sony全自动流式细胞分选仪SH800筛选具有功能活性的Cas9-CP（分选不表达RFP信号的菌株）。接着对其切割基因能力进行评估。在稳定表达GFP的单克隆HEK-LMP-10报告细胞转染表达野生型Cas9，特定Cas9-CP蛋白或阴性对照（sgNT），通过流式对比GFP荧光强度。从下图数据中能得出结论，Cas9通过CP方式重排产生新的蛋白质，可以维持野生型水平的DNA结合和切割能力。综上，Sony全自动流式细胞分选仪SH800无论作为筛选平台还是确认编辑效率都起到了重要作用。

    

CP重排的过程中涉及将这种蛋白的末端与肽接头（peptide linker）连接，同时在不同的位置上分割它的序列，从而产生新的相邻的氨基端和羧基端。作者团队通过对肽接头设计，可产生蛋白酶感应型Cas9（protease-sensing Cas9, ProCas9），即可理解为给always-on的Cas9安装了一个调节开关，在匹配的病毒蛋白酶出现后才加以切割，激活ProCas9产生大量的DNA损伤并杀死受感染的细胞。因此，Cas9-CP和ProCas9将允许工作者们更好地了解疾病过程，并且能够让CRISPR-Cas基因组编辑和修饰的转化应用更加安全。

 

Emmanuelle Charpentier

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶

 第二篇是Emmanuelle Charpentier等人今年刚刚发表在nature chemical biology的一篇文章：“Bridge helix arginines play a critical role in Cas9 sensitivity to mismatches”[2]。Cas9可特异性结合并切割DNA，与位于原间隔子相邻基序（PAM）上游的CRISPR RNA（crRNA）的间隔区序列互补。双向导RNA或单向导RNA（tracrRNA）的crRNA间隔子与目标DNA链的足够碱基配对会导致非目标链的置换和R环形成。完成此过程后，Cas9核酸内切酶结构域HNH和RuvC分别切割目标链和非目标链，导致双链DNA 断裂。正如上文所说，目前该技术最大问题之一就是容易产生脱靶切割，导致该现象的机理尚未完全了解，本文研究重点便是哪些区域和氨基酸能够阻止该现象发生，从而提高Cas9的特异性变体。研究发现，Cas9桥-螺旋中的精氨酸影响sgRNA，以及目标DNA结合和裂解。它们分为两组，分别增加或降低Cas9对错配的敏感性。桥-螺旋对于R环形成必不可少，并且R63和R66通过在存在错配的情况下稳定R环来降低Cas9特异性。此外，Q768可以降低Cas9对PAM-远端错配的敏感性。作者利用Sony全自动流式细胞分选仪SH800对EpCAM蛋白表达情况检测发现，Cas9_R63A / Q768A变体在人类细胞中显示出更高的特异性。由于Sony全自动流式细胞分选仪搭载微流控芯片，芯片与上样管路可随时更换，可以做到长期兼容分析和分选实验，一机两用，提高实验效率。 
 

基因编辑技术的广泛应用和迅速发展，提高了人们解决遗传病，癌症等问题的信心，科学家们正迫切的加快研究进展，社会也聚焦了更多的关注。选择好的工具和技术组合，是提高工作效率的重中之重，Sony公司全自动流式分选仪和全光谱流式细胞分析仪在各自领域进行了技术创新，解决了基于传统原理流式仪的主要痛点，因此受到了包括诺奖获得者Emmanuelle Charpentier，Jennifer A. Doudna在内的一大批前沿科学家的信赖。Sony会一如既往地为广大科研工作者提供优质的产品和高效的服务。

   

创新微流体芯片液流系统：

全自动化校准，免除人为调试

样本全部流路均易于更换：

1分钟插拔式更换，可实现样本之间零交叉残留

可配备多达4根激光(405/488/561/638)：

覆盖所有常见荧光染料

3种规格芯片(70um/100um/130um)：

充分满足研究者对不同大小细胞的分选需求

单细胞分选及索引分选功能：

便于对目标单个细胞追踪溯源

 

参考文献：

1. CRISPR-Cas9 circular permutants as programmable scaffolds for genome modification. Benjamin L. Oakes et al. doi:10.1016/j.cell.2018.11.052.

2. Bridge helix arginines play a critical role in Cas9 sensitivity to mismatches. Majda Bratovič et al. doi.org/10.1038/s41589-020-0490-4