在恶性肿瘤的临床治疗中，靶向 CTLA-4/PD-1/PD-L1 等位点的单克隆抗体表现出了令人欣喜的抑制效果，但同时患者也出现了严重的免疫相关不良反应（immune-related adverse events, irAEs）。这些 irAEs 轻则引发炎症反应，重则导致身体脏器功能衰竭，据统计在 PD-1/CTLA-4 抗体治疗患者中约60%病人出现了严重的治疗毒性反应，因此极大地限制了免疫检查点抑制剂抗体的临床使用。

 

在肿瘤免疫治疗的临床研究中，常常可见 irAEs 反应，其分子机制目前仍不清楚，目前了解到 irAEs 病灶常见于胃肠黏膜、肝脏、皮肤和肺部组织。免疫抑制剂诱发（Checkpoint inhibitor-induced, +CPI）的结肠炎（+CPI colitis）属 irAEs 反应中最为常见的病症，特别是在 ipilimumab（anti-CTLA-4 mAb）和 nivolumab（anti-PD-1 mAb）治疗患者中。

在肠道组织中，CTLA-4 相比于 PD-1 分子表现出更重要的维持稳态的作用。在接受 ipilimumab 治疗的患者体内，常常可观察到轻微的结肠炎病症，严重的 +CPI colitis 患者所占比例略少，但也有约 10%-20%，并且严重时可危及患者生命。目前对于 +CPI colitis 的临床治疗方案一般是使用高剂量的皮质类固醇 corticosteroids，corticosteroids 的抗肿瘤反应机理目前仍未可知，我们仅知道其可以诱导增殖性 T 细胞凋亡。
 

由于 colitis 在小鼠模型中没有免疫反应表现，导致了 irAEs 免疫损伤机理的研究开展较为困难。近日来自 Harvard 医学院、麻省总医院和 Dana-Farber 癌症研究所的研究者们采用索尼全光谱流式技术（spectral flow cytometry）和单细胞 RNA 测序技术（scRNA-seq），对 +CPI colitis病人进行了蛋白组学和基因组学两个层级的功能表型鉴定，探索了irAEs反应中各免疫细胞亚群的表型动态变化，力图筛选出可供介入治疗的潜在信号靶点。

 

队列研究思路

图 1. +CPI colitis 单细胞组学与 biopsy 组织采样分析流程

 

作者设置了三组研究对象：黑色素瘤患者伴发 +CPI colitis（8 人），黑色素瘤患者无 +CPI colitis 炎症伴发（6 人），以及健康对照组（8 人）。所有 +CPI 组患者均注射了 CTLA-4 与 PD-1 抗体，其中每组余一人仅注射 anti-CTLA-4 mAb。当 colitis 病症出现后，立即对肠粘膜三个部位（rectum，sigmoidal 和 descending）进行活检确认，同时对粘膜固有层和肠上皮层组织采样制备单细胞悬液，流式分选 CD45+CD3+ 细胞用于单细胞 RNA 测序，结合光谱流式多色 panel 检测 marker 表达变化。

 

+CPI Colitis 炎症组织中免疫动态变化

图 2. CD45+ 免疫亚群动态分布

 

通过分析 16 个样本中 CD45+ 细胞 scRNA-seq 数据的转录组表达差异，可将 CD45+ 细胞细分为 16 个表型亚群，包括常见的 T cells, B cells, IgA+ plasma B cells, myeloid cells, mast cells 和 innate lympoid cells。+CPI colitis 组与对照组的显著差异在于 T 细胞亚群的比例变化，特别是 CD8+ 毒性淋巴细胞(CTL)和 cycling T cells 两个亚群。光谱流式分析结果同样显示，+CPI colitis 组 CD3+ 亚群比例出现明显上升。

图 3. CD8+ T 细胞毒性功能与活化功能表征

 

由于 CTL 细胞出现显著性增多，研究者深入分析发现 CTL 细胞可继续细分为 8 个亚群：cluster 7（毒性效应细胞）和 cluster 8（cycling T cells）在 +CPI colitis 组具有独占性分布表现，上述两群细胞具有毒性蛋白基因高转录活性，包括 GZMB 和 IFNγ 应答基因（HLA-DRA & CD74）；另有 cluster 5/6（中枢记忆/幼稚细胞；终末效应细胞）同样出现显著性增多，而组织驻留记忆 T (Trm)细胞比例明显降低。

接受了 ipilimumab 治疗的 colitis 患者同样出现高比例的 granzyme B+ CD8+ T cells，表明毒性 CD8+ T cells 亚群的动态变化与免疫抑制剂的使用并没有严密联系。结合 scRNA-seq 数据分析，研究者用光谱流式确认了相关免疫亚群的表型变化：+CPI colitis 组 cycling (Ki-67+) granzyme B+ CD8+ T cells 比例明显上调，同时 Trm 亚群比例显著下降，与基因水平的表达变化一致。

图 4. CD4+ 效应细胞与 Treg 细胞亚群分布

 

与 CTL 亚群类似，CD4+ T cells 可细分为 10 个亚群，其中 cluster 9（Th1 effectors）和 clusters10（Treg cells）在 +CPI Colitis 组占据绝对主导。CTLA-4 高表达于 FoxP3+ Treg cells 中，尽管目前还未有临床数据，但理论上针对 CTLA-4+ Treg cells 的耗竭处理可引起严重的 irAEs 反应。在本文研究中，光谱流式分析结果显示 +CPI colitis 组 FoxP3+ 亚群比例显著上调， FoxP3 蛋白表达量同样明显上调。

图 5. FoxP3+ Treg 亚群中 CTLA-4 表达变化

 

T 细胞亚群抑制信号状态变化

图 6. CD8+T 亚群中 CTLA-4 表达变化

 

接着作者检测了炎症环境中 CD4+/CD8+ T 细胞的抑制信号受体表达情况，colitis+ 组 CD4+/CD8+ T 细胞 CTLA-4 基因明显表达更为活跃，同时流式也可检测到 +CPI colitis 组 CD8+ T 细胞高表达 granzyme B 和 CTLA-4，从蛋白组水平提供了 CTLA-4 信号的活化证据。作为近年来的热门靶点，靶向 TIM-3 和 LAG-3 的抗体研究愈加受肿瘤免疫治疗方案的重视，本文结果也证实，+CPI colitis 组中 CD8+ T 细胞中 TIM-3 和 LAG-3 的编码基因 HAVCR2 和 LAG3 表现出显著性表达上调。

通过筛选 colitis 炎症中的分子信号反应，研究者找到了毒性基因 GZMB 和 GNLY (CD8+ T cells) 以及 GZMA (CD4+ T cells)在对照组和 colitis+ 组中的显著性差异表达，暗示了其有作为介入靶点的潜力；同时 IFNγ 信号也表现出了明显的表达上调，作为 IFNγ 信号通路的下游，T 细胞激活也将增强 GBP5 与 MHC II 所负责的抗原呈递通路（HLA-DR/CD74）。

 

图 7. 髓系亚群中炎症反应相关因子表达变化

 

通过对所有 CD45+ 细胞的表达分析，作者发现 colitis+ 组髓系细胞群中 IFNγ 和 TNFα 信号显著增强，包括编码趋化因子的 CXCL9 和 CXCL10，可有效募集 CXCR3+ 效应 T 细胞至炎症位点发挥杀伤能力。髓系细胞可分为三个巨噬/单核亚群，一个 DC 亚群和一个吞噬 T 亚群。+CPI colitis 组 Cluster 1 (macrophage)表现出高表达 IFNγ 信号水平，包括 CXCL9 和 CXCL10 因子；同时 cluster 1 也表现出明显的 TNFα 信号表达，说明了 IFNγ 信号可调控髓系细胞的趋化因子表达水平，具有募集效应 T 细胞至炎症中心的促进作用。

 

潜在信号通路的介入靶点分析

图 8. CD45+ 免疫体系中趋化因子受体与细胞因子所属活化亚群分析

 

基于以上研究数据，研究者分析总结了两条可能的 +CPI colitis 炎症治疗分子机制：T 细胞募集活化途径和可溶性炎症调控因子途径。

1）T 细胞募集需要趋化因子受体 CXCR3 和 CXCR6 的协同作用，两者均高表达于 +CPI colitis 组；αEβ7 integrin 作为 Trm T 细胞特征 marker，可增强 T 细胞对 E-cadherin+ 上皮细胞的黏附作用，也可促进 T 细胞从血液浸润至肠道中。已有临床数据显示靶向 αEβ7 integrin 的抗体药物 vedolizumab，具有显著的 +CPI colitis 抑制效果。

2）+CPI colitis 组表现出多种细胞因子的信号激活，包括 TNF，IL1B 以及 OSM。临床数据表明 TNFα 信号抑制可显著降低 +CPI colitis 炎症反应，反之 TNFα 信号活化可增强 +CPI colitis 炎症作用；NLRP3 炎症小体的活化可刺激 IL-1 的表达释放，同样有临床实验证实，使用靶向 IL1-β 的抗体药物 canakinumab 可有效抑制肿瘤发生。

 

光谱流式多色 panel 检测优势

 

本文同时使用了基因组学和蛋白组学两种方法，对 +CPI colitis 免疫状态变化进行了细致入微的表征研究。在本篇研究的蛋白组学分析中，为验证 scRNA-seq 结果作者设计了 15 色的流式多色 panel，从蛋白组学角度为测序结果提供了细胞功能表型数据的有力补充。作者选择了 Sony SP6800 全光谱流式分析仪为检测平台，对 10 个表面 marker 以及 4 个胞内 marker 做了探索分析。

全光谱流式分析仪 Sony SP6800

 

得益于全光谱流式技术，SP6800 可以实现胞内弱表达 marker 全部荧光发射信号的连续收集，结合优化改进的数学算法（加权最小二乘法），以客观无偏差的光谱解析方式呈现出分群更加清晰明确的荧光表达信号。

光谱流式 SP6800 胞内 marker 表达检测数据

 

总结

通过单细胞测序以及光谱流式多色 panel 检测，作者分别从基因组学水平和蛋白组学水平表征鉴定了 +CPI colitis 患者炎症组织中免疫细胞亚群的动态变化，以及效应 T 细胞的免疫因子分泌功能和毒性杀伤能力的变化调控，为 +CPI colitis 以及其他 irAEs 反应的免疫治疗提供了大量翔实丰富的临床数据，有助于相关领域学者继续寻找可能的潜在介入治疗靶点。

 

Reference:

Luoma et al., Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy, Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.001