岁末年初，突如其来的2019-nCov疫情迅速在全国各地蔓延。让大家再一次感受到了“小小”病毒蕴含的“大大”破坏力。随着疫情逐渐趋于稳定，血清治疗，干细胞治疗，疫苗研发等研究已经迅速开展。 
据世界卫生组织数据表示，目前全球共有20多种2019-nCov疫苗正在研发阶段，一些治疗方法正在进行临床试验，预计于几周内获得首批结果。[1]而抗体，是机体对抗病毒感染最重要的武器之一，对抗体药物的研发也就成为了科研和临床工作者的重要课题。事实上，随着抗体工程技术的发展，嵌合抗体，人源化抗体，双特异性抗体等各种新型抗体的出现，让治疗性单克隆抗体（Therapeutic Monoclonal Antibody）已经逐渐成为了治疗病毒感染的重要手段。

特异性识别埃博拉病毒（EBV）糖蛋白单克隆抗体（mAb)，可以从小鼠、人Ig转基因小鼠或人类本身进行分离。采取的分离方法有：杂交瘤细胞法、EBV转化、单细胞分选技术等。可以利用亲和力成熟和Fc修饰技术来提高mAb的效价。通过向质粒DNA中插入抗体可变区的重链和轻链生产重组抗体，用于后续预防和治疗[2]。
 

单克隆抗体分离的不同方法

如上图所示，无论后续如何对抗体进行改造，分离出候选的单克隆抗体仍然是整个研究的基础。最初，科学家们主要通过杂交瘤技术分离小鼠mAb，随着技术的发展，人们开始利用RT-PCR和噬菌体展示技术进行分离。但问题也显而易见，重链和轻链通过随机配对的方式进行组合。
为了解决这个问题，科学家们采取的其中一个办法是EBV介导的B细胞转化。通过加入TLR9激动剂CPG，环孢菌素，凋亡抑制剂（如小分子Chk2抑制剂）等均可提高转化为淋巴母细胞系（lymphoblastoid cell lines，LCLs）的效率。然后利用有限稀释法或通过流式进行单细胞分选进而形成单克隆。另外，使骨髓瘤细胞与LCLs电融合可以提高后期形成克隆的比例。[3]

另外一个方法是标记抗原特异性B细胞。随着抗原（antigen）标记技术的提高，现阶段antigen-special cell筛选的灵活性和效率大大增加。研究人员可以利用MHC单体和肽段自由组装，来筛选抗原（如ELISA方法），标记细胞然后利用流式细胞分选仪对抗原标记的B细胞进行分选，这种分离方法不但更加精确，而且分选后的单个细胞可以直接用于获得抗体基因。提高了抗体生产效率。

除了上述的方法，当然还有其他的发现、技术正在应用于抗体的分离。例如Jens Wrammert等人[4]发现抗原特异性B细胞在接种疫苗后的短时期内（大约5-7天）会在外周血中以浆细胞形式循环。这意味着可以把所有的循环浆细胞都分离出来，节省了特异性抗原筛选的步骤。

单克隆抗体治疗性评价

病毒感染人体后，人体会产生多种virus-specific mAb抗体。但其中大部分缺乏抗病毒能力。只有能与病毒表面蛋白结合的抗体，才有可能产生抗病毒作用。因此对分离出的抗体进行的第一步研究便是与病毒表面蛋白重要位点的结合能力及其治疗性机理探索。

以埃博拉病毒（EBOV）为例，

埃博拉病毒的外壳含有一个单一的表面蛋白，糖蛋白（glycoprotein, GP），它由GP1和GP2两个亚基组成一个三聚体。    GP的作用是保证病毒与宿主细胞的粘附、与细胞膜融合，进入细胞核内。因此GP成为了中和单克隆抗体（mAbs）和疫苗设计的主要靶点。
GP1有一个高度糖基化的粘蛋白样结构域和一个多糖帽(glycan cap)，该结构保护着病毒与宿主受体结合位点（receptor binding site，RBS）当病毒入侵宿主细胞核时，通过组织蛋白酶介导，GP上的该结构裂开形成GPCL，使RBS暴露出来，与细胞核Niemann Pick C1（NPC1-C）蛋白结合。进而引起GP2结构重排，与细胞核融合，使得EBOV的遗传物质能够进入核内。[4]

该篇文章中[5]，作者通过两位EBOV感染幸存者的PBMC，生产了600多株EBOV GP反应性LCLs细胞，用ELLSA binding方法检测了每个细胞株结合EBOV三个亚种（EBOV, BDBV, and SUDV）的能力，进而分离出16个序列唯一的mAb，其中三支（EBOV-442, -515, and -520)可以中和全部三个病毒亚种。

接下来，作者将EBOV GP表达在Juckat细胞表面（Jurkat-EBOV GP）。通过流式的方法，进一步研究了不同抗体与GP结合的特征，进而分析抗体中和性产生的机理。

A Cell surface displayed GP mAb binding

EBOV special mAb既可以通过荧光素标记试剂盒进行直接标记，也可以通过荧光素标记的anti-human Ig抗体进行间接染色。通过流式仪分析荧光强度确定抗体与GP或GPCL结合能力，推断抗体结合位点是否在多糖帽上。背景值可选用未转染细胞染色结果确定。

B Cell surface displayed GP mAb competition-binding

首先将未标记的mAb与Jurkat-EBOV GP孵育，随后加入标记荧光的另一种mAb进行染色。通过荧光信号下降比例判断两只抗体的竞争性。荧光信号降低到30%以下认为是强竞争，30-70%之间是中等竞争，70%以上认为是弱竞争性的。

C Cell surface displayed GP cleavage inhibition

Jurkat-EBOV GP先与不同稀释梯度的mAb孵育，然后加入嗜热菌蛋白酶（thermolysin）使GP转变为GPCL，加入荧光标记的特异性识别RBS的单抗MR78。背景值选用MR78染色未处理的Jurkat-EBOV GP细胞。通过荧光信号来判断mAb的中和作用是否靠抑制GP的裂解而实现。

D Cell surface displayed GPCL soluble NPC1-C binding inhibition

Jurkat-EBOV GPCL细胞加入不同稀释梯度的mAb孵育，然后加入可溶性的嵌入Flag标签的NPC1-C重组蛋白进行孵育。然后用荧光标记的anti-Flag抗体染色。通过荧光信号来判断mAb的中和作用是否靠抑制RBS与NPC1-C结合而实现的。

从数据中不难看出，不同抗体虽然都能产生中和作用，但各自机理不尽相同。那么抗体的中和作用如何测定，跟流式是否相关？非中和抗体在抵御病毒过程中又起到了什么作用？小编会在下期接着为大家解读。

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参考文献

1. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 28 February 2020. https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19---28-february-2020

2. Ami Patel et al. It Takes a Matured mAb to Treat Ebolavirus Infection. Cell Host & Microbe https://doi.org/10.1016/j.chom.2018.12.013

3. James E.CroweJr. Principles of Broad and Potent Antiviral Human Antibodies: Insights for Vaccine Design. Cell Host & Microbe https://doi.org/10.1016/j.chom.2017.07.013

4. Jeffrey E. Lee et al. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature volume 454, pages177–182(2008)

5. Pavlo Gilchuk et al. Multifunctional Pan-ebolavirus Antibody Recognizes a Site of Broad Vulnerability on the Ebolavirus Glycoprotein. Immunity https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.06.018