SARS-CoV-2

新型冠状病毒SARS-CoV-2正在全球范围内传播肆虐，WHO situation report显示截止2月24日，COVID-19患者累计共有79331例，死亡2618例。国内临床数据显示现阶段SARS-CoV-2感染致死率约2.3%，鉴于SARS-CoV-2病毒的突发性，目前还未出现有效可用的抗病毒特异性临床疗法。
SARS-CoV-2感染患者临床特征早期表现为发热干咳、呼吸困难，危重患者会快速出现显著的呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭，其可能的主要原因是患者体内产生了炎症因子风暴。由于患者免疫系统的过度激活，免疫细胞持续过表达大量的促炎症细胞因子包括干扰素IFN、白介素IL 、趋化因子和肿瘤坏死因子TNF等，引发了患者体内组织器官的功能衰竭，最终导致死亡。因SARS-CoV-2与SARS-CoV以及MERS-CoV同属Coronaviruses家族beta冠状病毒谱系，并在基因组上与SARS-CoV表现出79.5%的序列相似性。同时在SARS以及MERS患者的病变过程中，炎症因子风暴已被证实是引发患者死亡的重要原因，而本次COVID-19患者在临床治疗过程中也出现了明显的炎症因子风暴反应。通过回溯SARS-CoV引发免疫损伤的研究内容，可以帮助我们更加清晰地了解到SARS-CoV-2在感染致病过程中的机体免疫反应，有助于探索SARS-CoV-2感染诱发炎症因子风暴中的关键途径，了解其具体的信号激活诱发机制，为临床治疗和相应的药物开发提供潜在的介入靶点。
在本篇文章中，研究者通过构建MA15 SARS-CoV小鼠感染模型，发现伴随着病毒复制过程中滞后反应的I型IFN信号通路（IFN-I signaling）对机体炎症反应和肺损伤存在促进作用。当IFN-I先于病毒滴度（virus titers）出现顶峰时，可有效改善病毒引发的免疫病理损伤。相反延后出现的IFN-I将促进浸润性单核巨噬细胞（IMMs）不断聚集，释放大量促炎症细胞因子，导致机体出现炎症因子风暴反应，以及异常的病毒特异性T淋巴细胞免疫反应。

敲除IFN-I可有效改善SARS-CoV感染小鼠发病率和死亡率
研究者使用高剂量SARS-CoV感染幼龄BALB/c小鼠，接受感染3天后小鼠表现出嗜睡，皮毛卷曲，躯体弓缩以及呼吸困难等症状；5天后小鼠出现明显肺部充血，病理切片结果显示同时存在肺泡水肿、支气管末端上皮脱落、间质膜增厚等症状；感染8天后所有小鼠均出现显著性体重减轻以及多数死亡现象。与之相反的是敲除了IFN-I信号的Ifnar-/-对照组小鼠全部存活，仅有约15%的体重丢失；同时肺部无明显充血现象，仅有轻微肺泡水肿和逐渐增加的血管外周免疫细胞聚集现象。即使病毒剂量加大至10^5 PFU，Ifnar-/-组小鼠仍可表现出惊人的100%存活率。在中龄BALB/c小鼠感染组中，同样出现了高度相似的病变结果，而Ifnar-/-组小鼠依然能够幸存。两组小鼠的体内病毒总滴度在监测周期内基本相似， 感染10天后Ifnar-/-组体内病毒已基本被清除干净。


Fig 1. Type I interferon signaling promotes lung pathology following lethal SARS-CoV infection

SARS-CoV感染具有病毒快速复制与IFN-I表达滞后特点
研究显示SARS-CoV具有体内快速增殖的特点， BALB/c小鼠在接受感染后16h即可检测到滴度顶峰的病毒复制活动。IHC结果显示感染组小鼠肺部支气管与薄壁组织II型肺泡细胞处存在明显病毒复制痕迹，24h后病毒抗原即可遍布于整个肺部支气管和薄壁组织中，这与SARS病人的IHC结果基本一致。


Fig 2. Lung virus titers (A) and immunohistochemical examination (B)

IFN-I在机体固有免疫反应的初始化激活过程中极为重要，但研究者直到24h时间点才于感染组小鼠肺泡灌洗液中检测到IFN-I表达的出现，同时炎症因子和趋化因子如CCL-2/TNF/IL-6等均表现出类似的滞后表达现象。而在Ifnar-/-组中，所有炎症因子的表达水平均被调控在极低的水平。这一现象可能与之后的固有免疫系统过度激活具有密切联系，紧接着研究者考虑了IFN-I表达顶峰先于病毒滴度顶峰出现是否有助于提高感染存活率。通过不同时间点的IFN-β (2000 U)给药处理，实验发现感染后当IFN-I在6h时间点处先于病毒滴度达到表达顶峰时，实验组小鼠表现出明显降低的体重丢失率，感染存活率显著升高；当IFN-I在12h时间点处达到表达顶峰时，可实现中度的存活率提升效果；而当IFN-I在24h时间点处达到表达顶峰时，小鼠病变症状以及存活率均与对照组表现一致，完全没有任何改善作用。


Fig 3. BALF cytokine/chemokine levels from BALB/c and Ifnar-/- mice (C); mice survival and lung viral loads result after treatment with IFN-β (D)

肺部组织出现过量表达的IFN-I因子，但这些因子从何而来？已知浆状树突细胞（pDCs）和肺泡巨噬细胞（AMs）在RNA病毒感染中是IFN-I的主要来源，研究者使用磁珠分选pDCs (Siglec-H+)和AMs (Siglec-F+)细胞，通过qRT-PCR方法发现感染组小鼠体内pDCs显著表达了IFN-β和IFN-α4 mRNA，这一现象和SARS患者的pDCs过表达IFN完全一致。另外组织染色结果显示，肺部气管和间质细胞中也存在IFN-I表达情况。综上，感染组小鼠肺部多种细胞均可表达IFN-I，但其最主要来源仍是pDCs。


Fig 4. IFN-α4 and IFN-β mRNA transcript levels of pDCs and AMs (F); immunohistochemical examination for IFN-β expression in the lung airway and lung parenchyma (G)

IFN-I Signaling负责募集活化IMMs
结合上述实验结果，研究者认为固有免疫细胞的募集和活化可能与IFN-I signaling关联。通过测试中性粒细胞、NK细胞、pDCs和AMs的总细胞数比，结果表明感染组小鼠肺部组织中Ly6Chigh/CD11b+细胞比例出现显著性升高，相比于Ifnar-/-组浸润性Ly6Chigh/CD11b+表现出近6倍的增长，同时上述细胞群可表达CCR2、F4/80和CD11c marker，且Ly6G和siglec-H marker检测为阴性表达，因此可确认此细胞群为IMMs。此外相比于Ifnar-/-组，感染组小鼠IMMs具有更强的CD69、BST-2、CD80和CD86 marker表达，符合更强的激活效果。


Fig 5. Kinetics of Ly6Chigh/CD11b+ (A/B) and phenotypic marker expression (C) of inflammatory monocyte accumulation in the lungs; cell surface levels of activation markers on lung IMMs (D)

CCL-2/7/12属于CCR2与GM-CSF配体，参与IMMs募集过程。研究发现CCR2配体在感染后24h以及72h时，表达出现明显降低；GM-CSF在16h时间点时即有表达降低现象。CCL-2主要由IMMs负责表达，IFN-I signaling可直接调控骨髓细胞的CCR2配体表达降低。故而IFN-I signaling可以促进SARS-CoV感染的肺部IMMs聚集，且这一过程可由IMMs表达的CCR2配体形成进一步的放大效果。


Fig 6. CCR2 ligand and GM-CSF mRNA levels of infected lungs (B); intracellular CCL2 expression level in IMMs (C)

为确认IMMs是否也表达促炎症因子，研究者提取了感染组和对照组小鼠的IMMs，结果显示IMMs表达TNF、IL-6 、 IL-1β和iNOS因子，且具有较高的表达比例。由于CCR2特异性高表达在促炎症单核细胞表面，通过使用anti-CCR2抗体（MC21 mAb）可以耗竭IMMs，处理组肺泡灌洗液样本检测结果显示CCL-2、TNF和IL-6表达显著性降低，证实了IMMs是感染肺部的促炎症因子的主要释放源。


Fig 7. IMM depletion levels in infected lungs (A); pro-inflammatory cytokines and chemokine levels in BALF (C); total number of cytokine positive IMMs in the lungs (E)

IMMs耗竭可显著改善病毒感染诱发病症
为探究肺部感染的免疫病理损伤与IMMs浸润聚集间的联系，研究者使用MC21 mAb耗竭处理IMMs。结果显示处理组表现出免于致死性的保护作用，anti-BST-2（活化IMMs高表达BST-2）对照处理组同样显示出明显的改善作用，而Ig对照组仅有约30%的存活率，确认了IMMs在促进SARS-CoV引发的高致病率和致死率中的重要作用。


Fig 8. Weight curves and survival of SARS-CoV-infected BALB/c mice

IHC结果显示MC21与anti-BST-2 mAb处理组小鼠的肺泡水肿和支气管上皮脱落出现明显缓解。由于IMMs高表达促炎症因子，在经过TNF（促炎症反应调节因子）中和处理后，亦表现出明显的症状缓解效果。


Fig 9. Histological changes in the lungs (E); Weight curves and survival of control and anti-TNF-α antibody-treated BALB/c mice (F); Survival of SARS-CoV-infected BALB/c mice after neutrophil depletion (G)

此外中性粒细胞常被认为在呼吸道病毒感染中具有不利影响，然而实验显示感染组小鼠的中性粒细胞数仅比对照组高出些许，且中性粒细胞耗竭对于改善存活率没有显著影响。因而IMMs可证实为SARS-CoV感染过程中过激炎症反应引发的免疫损伤的主要因素。

IFN-I介导炎症反应使抗病毒T细胞反应失调

Fig 10. IFN-I signaling impairs T cell response

为清除体内SARS-CoV，免疫系统需要激活T细胞。作者使用MC21处理BALB/c感染组和Ifnar-/-对照组，实验发现相比于Ifnar-/-对照组和MC21处理组， BALB/c组体内病毒特异性CD4+ T cells (epitope N353)和CD8+ T cells (epitope S366)比例均出现明显降低。此外IFN-I可刺激T细胞发生凋亡作用，研究者检测了两组小鼠的T细胞凋亡比例，结果显示感染组出现了更高比例的CD4+/CD8+ T细胞凋亡现象。

总结

1. 感染组织中SARS-CoV的快速复制以及滞后表达的IFN-I signaling促使IMMs聚集，是引发血管渗漏和病毒特异性T细胞免疫异常反应的主要原因，最终导致了BALB/c小鼠的高发病率和死亡率。
2. 与SARS患者临床症状相似，小鼠模型同样表现出IFN-I以及炎症因子过表达引发的免疫病理损伤现象，同时巨噬细胞持续被募集活化至肺部组织。当外源性输入IFN-I先于病毒滴度达到表达顶峰时，IFN-I signaling可有效改善炎症因子爆发症状，缓解肺部损伤。
3. 伴随着CCR2配体的释放，IFN-I信号得到增强，使得IMMs不断聚集至病变部位，并进一步放大了IFN-I、CCL-2和其他炎症调节因子的过表达，最终因免疫系统过度激活引发细胞因子风暴形成。
4. T细胞在病毒感染下出现异常应答，使得固有免疫系统的激活途径不受控制，两者共同引发了促炎症因子的持续表达，形成超出机体承受范围的炎症风暴，并最终导致了严重的免疫损伤。

Reference:

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