索尼流式分析平台采用光谱解析技术为细胞与微生物样品分析提供新方法。为荧光群体可视化提供了保障。这篇文章讨论了相比于传统流式荧光补偿计算方法，光谱解析方法的优势。

传统流式与光谱技术收集数据的方法

图1.流式光谱分析概念

传统流式细胞分析仪采用带通滤光片与独立通道的PMT收集流式数据（图1）。对比这些系统，索尼流式光谱分析仪采用一组棱镜，分解发射荧光光谱，分解后的发射荧光通过32通道PMT检测每个颗粒的光谱信息。


图2.传统流式数据和光谱分析数据
图A和B显示传统流式和光谱流式如何处理来自某一荧光素染料1的检测信号。在传统流式中，每个检测器对应了某一荧光素。例如染料1发射荧光在1通道FL1被认为是荧光信号，在FL2和FL3的信号称为溢出。该信号和溢出组成了溢出矩阵。光谱分析技术使用来自所有通道的信号来产生染料1的发射信号并组成参考光谱。

在光谱分析中，无论需要分析多少荧光素，每个荧光信号来自所有通道的检测结果。因此，在传统流式细胞分析仪上，检测器的数量决定了荧光素的数量。传统流式细胞仪上的检测器和荧光素一一对应（例如，FL1对应检测FITC，FL2检测PE），因此检测器的数量与荧光素的数量是一致的。当获取来自某一荧光素的荧光信号，FL1中的信号被认为是“信号”，漏入其他通道的信号被称为“光子溢出”。来自其他通道的这些信号组成光子溢出矩阵，用来计算荧光补偿（图2）。
相比而言，光谱分析仪采用来自所有检测通道的信号，无论分析多少个荧光素。因为检测器的数量通常比荧光素的数量多，每个染料检测从360nm至920nm的荧光信号。因此对于光谱分析技术而言，检测器数量大于或者等于染料的数量。使用光谱分析单个染料，染料1使用所有的检测通道产生一个发射光谱信号。发射光谱信号用来建立染料1的参考光谱，反过来再将参考光谱应用于光谱解析计算（图2）。



图3.对比“补偿”和“光谱解析”
这些图阐述了如何使用补偿矩阵A计算荧光补偿的概念，以及如何使用参考光谱B解析光谱的概念。在这两种计算中，检测到的信号被分解为染料（染料1，染料2和染料3）的发射光谱的组合，并计算每种染料的强度。

在数学上荧光补偿与参考光谱类似，对于荧光补偿与光谱解析是相同的。图3显示了传统流式荧光补偿与光谱解析在三色检测上的比较。传统流式细胞仪使用补偿矩阵值计算最终检测到的信号强度。在光谱分析中，参考光谱使用3种染料来计算光谱解析。尽管计算结果类似，但是光谱分析可以让研究者看到完整的荧光发射信号而不是带通滤光片的信号，同时能将自发荧光作为一种单独的荧光分析。

传统荧光补偿与光谱解析对噪音的控制



图4.处理噪音的不同方法
此图描述了传统流式补偿A和光谱解析B中的噪音。在传统流式中，补偿计算后经常会产生一组唯一的结果，因此在检测信号中的噪音会直接影响染料的荧光强度。在光谱解析中方程解析的剩余值，多数的噪音即为解析后的剩余值。

在光谱分析中高数量的检测参数为处理荧光噪音提供了极大的灵活性。传统流式补偿需要计算的输入参数数量（检测器）等于输出参数数量（染料）。从数学角度上，它通常通过求解系统的单一矩阵方程式获得唯一的答案，这并不是理想的控制残余噪音的方法。但是在信号检测中噪音的控制十分重要，会直接影响染料荧光强度的检测结果（图4）。另一方面来说，光谱分析中允许输入参数比输出参数多，同时光谱分析方程能以最小噪音方式进行解析（图4B）。光谱分析方程式能处理各种情况的结果，因此，计算的目的是评估最合理的结果。这种方法的目的是将噪音对染料荧光强度计算结果的影响降到最低。

光谱解析的算法


图5. 最小二乘法（LSM）和加权最小二乘法（WLSM）
A. 最小二乘法（LSM）和加权最小二乘法（WLSM）的方程式，在LSM中所有通道的剩余值平方和最小，在WLSM中，加权计算值被加入到每个通道的剩余值平方和计算中。
B. 加权计算值λ用来计算每个通道的荧光强度。
C. APC-Cy7单阳，PerCP-Cy5.5单阳，未染磁珠样品分别通过LSM和WLSM算法分析。

其中最简便的算法为最小二乘法（LSM）。这最大限度降低了在结果中剩余值的平方和。LSM方法假设出现色散均匀地通过所有通道，像一个白光噪声。然而，这是不正确的，因为对于每个检测通道，色散的水平不同，决定了不同的信号强度。由于LSM不考虑这一点，结果过度拟合到明亮的通道。为了提高准确性，索尼引入了加权最小二乘法（WLSM）。在WLSM中，残差的平方值是单独加权（图5A），这个加权计算值使得在明通道的剩余值比在暗通道的剩余值低（图5B），WLSM考虑到了在检测信号中实际噪音模式，保证了每个染料荧光强度的计算值更为准确。图5C说明了在单染磁珠样品中，通过LSM算法与WLSM算法解析Percp-Cy5.5与APC-Cy7。对比结果显示，WLSM提供了更为集中、少偏离的数据，尤其在APC-Cy7阳性磁珠的表现更为明显。

结论
总而言之，光谱解析分离单个光谱指纹图谱，让科学家们更好地观察和更深入理解每个荧光标记。它也提供了一个更全面的稀有群体的视野，降低了处理多激光激发多色荧光的复杂性。光谱分析收集了从360nm-920nm的光子，消除了自发荧光，提高了弱表达荧光信号检测的灵敏度。这些功能让科学家们更精确地分析荧光群体。光谱技术通过消除使用带通滤光片和传统荧光补偿矩阵的计算，简化了多色配色方案的设计，同时在实验流程和分析中更为灵活。

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