原代组织样品如肺脏由内皮细胞、上皮细胞、基质细胞和各种造血细胞等不同谱系的各种类型细胞组成。了解免疫细胞和结构细胞之间的相互作用对于肺部疾病（如哮喘）的研究至关重要，其中识别和量化不同的细胞群至关重要。高维流式细胞术尤其是光谱流式对组织驻留细胞和募集的炎症亚群进行精确的表型分析和定量，有助于识别和理解健康和患病受试者之间的差异，探索发病机制、病程进展和治疗手段。

 【1】样品和多色方案

 

• 样品：屋尘螨提取物 （HDME） 诱发的严重哮喘的雌性C57BL / 6小鼠（12周龄），从肺组织中分离出肺单细胞，用于制备未染色、单染、FMO和全染管。
• 方案：根据商业可用性，通过考虑抗原分类、抗原共表达、荧光染料亮度以及与其他荧光染料的相似性来选择抗体和荧光染料组合（表1）。

• 抗体滴定：滴定所有抗体找到最佳滴度后，将单染管结果和全染管进行比较，针对结果不匹配的，进一步调整全染管里的抗体稀释度，直到匹配确定最终使用的染色浓度。
• FMO对照：阴阳性群没有明确分离的Marker，根据FMO对照定义门控边界。 

 

【2】AF的识别和解析

 

在具有复杂异质性细胞的组织中，AF 通常是高背景的来源，会掩盖微弱的荧光信号并降低检测器的可用动态范围。Sony ID7000™ Spectral Cell Analyzer软件中的AF Finder 工具非常强大，可在复杂的细胞混合物（如鼠肺）中识别和表征多种细胞类型的 AF 特征，解析后提升多个相关Marker的分辨率多达几个数量级。
 

图1. 使用Sony ID7000™ software (v1.1.10)中的AF Finder 工具鉴定未染色样品中独特的AF群。群 A、B 和 C 的光谱迹线几乎相同，解析时只使用了其中一个。群A、D、E、F光谱迹线是独特的，最终4种AF用于数据解析。
 

图2. 进行AF解析，显著提升分辨率，降低假阳性干扰。
 

图3. 根据AF特征追踪到特定细胞类型。AF color E在嗜酸性粒细胞中更强烈，在光谱的黄绿色区域（500–550 nm） 具有明显的发射，这表明存在黄素。
 

【3】鼠肺细胞亚群的表征

使用Sony ID7000™ software对上述20色方案全染数据进行包括AF的解混后获得的FCS文件，手动门控分析。
 

图4. 用于肺细胞表型的门控树。
 

图5. 肺细胞表型的手动门控策略。

 

图6. FMO对照。用于全染样品中为阴性和阳性事件之间分离不明确或参数表达低的参数设置门控边界确定依据。

 

图7. AF参与解析，提高了全染样品的分辨率。提高了 BUV395 的分辨率，从而能够更好地检测非造血/非 EC 组分（CD45-/Sca-1-;黄色门）（A）；AF532 的分离度也有所提高，有助于检测嗜酸性粒细胞（B）；提升PE 和 BV605 的信号分辨率，更准确地识别上皮杯状细胞 （C）。（A）中非造血/非EC亚群的鉴定不佳  ，导致门控策略下游事件的丢失，如图D上减少的α-SMA+群。
 

【ID7000™ Spectral Cell Analyzer】

高维流式细胞术为临床和转化研究中深入广泛表征免疫细胞亚群提供了强大的工具。Sony ID7000™超高参数全光谱流式细胞分析仪具有显著的优势，它允许：

1. 同时使用在传统流式细胞仪上不能兼容的发射光谱接近的荧光素组合；

2. 将免疫表型组的复杂性扩大到40+参数；

3. 解析多种细胞子集特异AF，进一步提升分辨率，同时消除假阳性信号；

4. 强大的3D高通量进样系统，实现无人值守式大量样本的数据采集和分析。

文中提供的基于Sony ID7000™超高参数全光谱流式细胞分析仪的20c小鼠高维光谱流式方案，能够清晰地识别小鼠肺加重哮喘模型中的各种特定细胞类型。在光谱解混中从多个群体中减去AF大大提高了多个通道的荧光分辨率。
 

Reference：

doi: 10.3389/fbioe.2022.827987