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化繁为简，洞悉流式中自发荧光背后的真相

人阅读发布时间：2024-03-04 20:14

自发荧光(Autofluorescence，AF) 常见于生物样本中，其产生机理是细胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH), 核黄素(VitaminB2) , 黄素单核苷酸(FMN)以及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等分子经激发光激发后产生的在可见光波长范围内(约400 -600 nm) 的本底荧光。这类本底荧光天然存在于各种细胞中，尤其是在包含复杂异质细胞的组织样本中，这类样本的AF本底信号会对实验结果产生严重干扰。

01/ 消除小肠与心脏细胞AF，保障结果准确性

来自法国巴斯德所流式平台的Schmutz教授一直以来受困于样本的自发荧光，无法获得真实荧光信号。自平台引进Sony SP6800全光谱流式后，Schmutz教授惊喜发现SP6800在实现2激光19色的强大检测能力之外，还可以鉴定样本自发荧光，消除困扰已久的假阳性信号。文章内容和protocol已发表在jove杂志，可前往观看[1,2]。

以小肠T细胞检测为例，CD3与TCRδ散点图中会混有高AF的内皮细胞，传统流式对此束手无策，令TCRδ-群中的CD3阴阳性无法有效区分。在使用光谱流式解析AF后，CD3+群中不再出现TCR-细胞。

作者继续分析了胚胎期心脏细胞，使用CD31和Sca-1标记内皮细胞和基质细胞，对比发现在传统流式上归类为CD45+Ter119+的造血细胞，光谱流式解析AF后可正确归类为心脏细胞。分选后的测序结果，显示其高表达心肌肌钙蛋白T和心房轻链-2转录产物，具有心肌细胞的特征谱。

02/ AF鉴定揭示胚胎期肝母细胞分化发育重要节点

肝脏是体内最大的实体器官，由多种类型细胞组成。但胚胎肝脏细胞的AF比较高，严重干扰了分析结果的准确性。巴斯德所Schmutz组[3]借助于旗舰型光谱流式Sony ID7000，设计了14色方案探索胚胎肝脏的发育轨迹。流式图显示，空白对照出现自发荧光显著的两个群体。

通过ID7000解析这两群AF，发现自发荧光AF1绝大多数（＞95%）由星状细胞产生，而AF2源自胆管细胞和肝母细胞。有趣的是，肝细胞亚群并没有表现出很高的AF2信号。因此，自发荧光AF2就成为了胚胎阶段，区分肝母细胞和肝细胞的重要依据。随着发育的进行，在出生3天、9天时采样，作者惊喜发现出生后胆管细胞失去了AF2的表达，意味着可以利用自发荧光AF2作为出生后鉴定肝母细胞的标志性参数。

03/ 高维全光谱流式同时解析6种自发荧光

美国克利夫兰诊所的Nicholas等[4]人设计了20色panel，旨在对屋尘螨（House dust mite, HDM）诱发哮喘模型小鼠肺组织驻留细胞的亚群分析。分析中发现未染色样本在许多荧光通道均有极强的自发荧光产生，利用Sony ID7000解析自发荧光，在6个不同的细胞亚群中解析出四条特征性的自发荧光光谱。去除自发荧光后，在各荧光通道得到完美的低背景信号结果。

此外，多个自发荧光参与光谱解析，去除了AF对各荧光通道的干扰，也提高了弱表达指标的分辨率，对稀有细胞的分析提供了强大助力。如嗜酸性细胞（Eosinophils）、上皮杯状细胞（Epithelial Goblet Cells）等多种细胞亚群在Unmixing Including AF的条件下得到更为理想的结果。