COVID-19肺炎仍在全球范围内广泛传播，目前已波及多达211个国家和地区。WHO已正式宣布COVID-19为全球大流行病，并呼吁所有国家立即披露针对COVID-19的战略部署。当前阶段除了尽力抑制病毒扩散和救治感染患者外，多个国家均已宣布投入更多资源用于SARS-CoV-2病毒疫苗以及中和抗体的相关研究，以期可以尽快拿到有效的治疗药物。



抗体和疫苗研究需要研究者们对病毒有足够的生物学了解，目前众多研究机构均已投入精力进行相关研究。但鉴于SARS-CoV-2的高传染性，如何在样本处理和分选过程中避免意外感染，是相关实验室需要高度重视的问题。NIH疫苗研究中心主任Stephen P. Perfetto于近日发表了一封公开信，介绍了在NIH IBC委员会(Institutional Biosafety Committee)审核下通过的实验室标准操作规则，如何就CoV-2细胞进行安全合规的流式分选操作，尽可能地保障研究人员在病毒研究过程中的自身安全。因血液样本的低风险性，美国CDC批准了NIH对于COVID-19患者的PBMC样本的流式分选实验，要求COVID-19患者的PCR阴性样本可在BSL-2级实验室中完成实验，同时需按BSL-3级要求进行操作。当涉及到高病毒滴度风险的生物样本时，必须首先进行安全风险评估，并建议在BSL-3级实验室或其他经过认证的专业生物安全柜中完成操作。

对于SARS-CoV-2分选操作，需满足以下BSL-2/3级要求：1）必须首先通过生物安全风险评估方可开展实验；2）实验室需有负压系统；3）使用气溶胶管理系统AMS（aerosol management system）；4）分选前需验证AMS系统有效性；5）AMS系统需配备HEPA filter；6）全身防护用具；7）打开分选舱时必须佩戴个人呼吸防护用具；8）建立详细SOP谨慎处理分选仪喷嘴堵塞事件；9）分选前后及时用70%乙醇或10% bleach消毒处理工作台；10）严格详细的实验室安全使用记录。其中红色highlight的四点因素至关重要，需全部满足。

分选实验室标准进入流程

1. 所有人员进入实验室前需先取得培训认证
2. 实验室进出权限由实验室主任考核发放，授权人需满足以下条件：员工需充分了解潜在的生物危害性；员工需接受安全操作考核并签收通过；员工需严格遵守所有操作规则；每年年度需重新安排安全操作考核
3. 实验室门外张贴警示标注，注明样本种类、相关操作人员的姓名和联系方式，以及进入实验室前可能需要的预防措施
4. 准备间穿戴防护用具，戴上双层手套
5. 缓冲间内确认所有防护用品没问题后进入分选实验室

分选实验室标准离开流程

1. 所有分选以及消毒工作完成后，使用10% bleach消毒个人防护用具
2. 离开实验室之前手套需使用10% bleach消毒
3. 脱下外层手套后进入缓冲间
4. 脱下个人防护用具
5. 脱下内层手套和实验服，丢入生物危害垃圾桶内
6. 当桶内垃圾超过2/3时，需立即清空垃圾桶
7. 使用肥皂清洗双手后离开准备间
8. 所有实验垃圾丢弃前需进行高温高压消毒处理，随后进行异地焚烧

分选实验流程

一、AMS气溶胶管理系统
高压条件下分选传染性生物样本，AMS系统必须全程开启，所有操作人员均需接受相关培训考核并取得操作资质方可进行分选操作。

1. 依照说明书启动操作AMS系统，分选空间需保证20%真空度，真空压力为1.0-1.5 SCFM。若压力不满足标准，禁止分选操作
2. 分选仓内需全程开启液流监控，确保操作者随时可以查看分选液流，以防因堵塞导致的气溶胶急剧产生

二、AMS气溶胶密度检测
为确保分选传染性生物样本时AMS系统的有效性，需定期排查AMS系统，建议每两月进行一次。

1. 注意操作人员在检查过程中需全程佩戴呼吸防护用具
2. 将cyclex-d真空泵放置于分选舱附近
3. 启动AMS系统
4. 配制Dragon Green beads (Bangs Laboratories, 1.01 um)溶液，放于上样仓内开始上样
5. 开启cyclex-d真空泵，设置速度为20 L/min
6. 开始分选beads，时间为10 min
7. 关闭真空泵并移出，关闭AMS系统
8. 使用新的cyclex-d真空泵收集气溶胶2 min，收集完毕后打开AMS
9. 取出cyclex-d中载玻片，荧光显微镜下观察绿色荧光beads数目
10. AMS工作时载玻片上beads数目需为0，AMS关闭时beads数目作为positive control
11. 若AMS工作时beads数目大于0，重新进行第二轮测试。如测试仍不为0，禁止操作分选实验

三、分选操作

1. 开机前清空废液桶，桶内加入足量bleach，保证桶满后bleach终浓度为10%
2. 启动仪器和软件，启动AMS系统，确认压力为1.0-1.5 SCFM
3. 按仪器操作提示启动液流，校准仪器
4. 操作人员需全程佩戴防护用具，房间内仅允许同时进入2人，关闭分选舱外所有屏障
5. 使用生物安全柜进行转移和过滤处理待分选样本
6. 分选过程中时刻注意观察液流监控，如发生喷嘴堵塞等问题导致液流不稳，需立即停止分选并暂停液流。重启液流后使用清洗液冲洗，如仍有堵塞，等待30 s后打开分选舱取下喷嘴，一级消毒处理30 min后进行超声清洗。镜下确认喷嘴通畅后装回分选舱内，使用setup beads重新校准液流
7. 仅当堵塞故障清除完毕后方可继续分选
8. 分选完成后等待至少30 s方可取出收集管
9. 完成关机清洗消毒工作
10. 停止液流，退出操作软件，关闭仪器主机和电脑
11. 样本转移操作：所有生物样本需先放入次级容器，随后进行一级消毒处理，且带出实验室前需再次进行二级消毒处理。所有样本在送至其他实验室进行测试前，需安排适当的生物防护处理，使用1% methanal 溶液等体积重悬样本溶液，4 ℃条件下孵育60 min以上，并在Class II或Class III生物安全柜中密封tube；使用一级消毒处理手套和tube，再使用70%乙醇继续处理，随后即可携带样本离开实验室
12. 分选后直接裂解的细胞样本，因样本已无传染性，可直接带离实验室

实验室安全注意事项

1. 实验室门全程保持紧闭
2. 实验室内全程穿戴手套
3. 实验室内禁止任何形式的吃喝、抽烟、化妆和触摸隐形眼镜
4. 实验室内禁用吸管
5. 实验室内禁止带入动植物
6. 禁止穿戴任何形式的露脚趾鞋类进入实验室，必要时可穿鞋套
7. 实验室内优先使用塑料物品，避免使用玻璃物品
8. 所有实验室操作人员需定期采集血清检测相应的病原体阴阳性
9. 所有关于传染性样本的操作均需在生物安全柜内进行
10. 所有实验相关试剂buffer均需保存在防渗漏容器中，并在丢弃前进行30 min以上的一级消毒处理。一级消毒使用10% bleach（每天新鲜配制），二级消毒使用10%碘伏或70%乙醇
11. 生物安全柜使用完毕后必须及时进行消毒清理，每次使用完，安全柜内禁止存放任何相关的实验垃圾
12. 当实验室内发生意外的样本倾洒事件后，首先使用纸巾覆盖于倾洒处，随后使用适当消毒剂浸泡30 min以上确保完全消毒，最后将所有物品丢入生物危害垃圾桶内
13. 任何形式的倾洒事件发生后必须第一时间通知实验室主任，由负责人进行安全风险评估
14. 当传染性样本操作完成后，需及时进行操作台表面消毒工作，特别是当倾洒事件发生时
15. 所有实验室均为负压气流，非负压条件下禁止进行分选实验
16. 定期进行防护用具的生物安全风险检查
17. 所有实验室操作人员需接受自己工作相关的生物危害性培训课程

实验室分选防护分级

Primary Barriers

1. 配备有AirMAX HEPA filter的动力式呼吸防护用具(powered air-purifying respirator, with NIOSH approved HEPA filter)
2. 实验室内全程穿戴双层手套，当手套污染或分选完成后方可脱下外层手套
3. 在离开分选房间进入准备间之前，必须使用一级消毒处理外层手套
4. 确保消毒并脱下外层手套后方可离开分选房间进入缓冲间
5. 脱下内层手套，消毒清洗双手后方可离开准备间
6. 实验室内全程穿戴一次性防护服

Secondary Barriers

1. 实验室房门全程紧闭
2. 当分选传染性样本时，实验室外需张贴警示标志，注明生物危害性、需进行的防护措施以及紧急联系人
3. 所有传染性样本均需在class II或class III级别生物安全柜中进行使用操作
4. 定期检查生物安全柜内的HEPA filter
5. 生物安全柜需放置于无明显障碍处，以防干扰气流

Third Barriers

1. 所有实验废弃物均需作为生物危害性垃圾处理
2. 所有废弃物在丢弃前均需放入灭菌锅内进行高温高压消毒处理

紧急撤离流程

1. 封存所有生物危害性样本和试剂
2. 关闭生物安全柜
3. 实验室工作台表面消毒
4. 10% bleach消毒个人防护用具
5. 脱下外层手套进入准备间
6. 脱下防护用具，清洗双手
7. 离开准备间，前往紧急撤离点

SH800/MA900是Sony基于专利蓝光技术研发的智能型自动化流式分选仪，具有4激光6/12色检测通道，可实现2/4路tube分选和多种规格的高精度微孔板分选。应用了创新的微流控芯片技术，将流动池与喷嘴整合到一张芯片中。因此发生堵塞时传统分选仪需进行复杂繁琐的清洗步骤，而Sony分选仪可选择在清洗步骤之外直接更换一张新的分选芯片，从而避免了喷嘴堵塞时可能的气溶胶污染事件；同时配合可简易更换的一体化上样管路设计，使得样本间高效率连续分选成为可能，避免了交叉污染的干扰结果。

同时SH800/MA900流式分选仪还可兼容经Baker公司定制设计的生物安全柜，适配了AMS气溶胶管理系统。这种安全柜符合各种适用的国际标准，包括美国国家基金会第49号标准（NSF49）和欧洲标准12469，可以为研究人员提供双重保护，助力SARS-CoV-2病毒抗体以及疫苗的深入安全研究！

Reference:

1. https://isac-net.org/news/news.asp?id=497501
2. NIH Vaccine Research Center - FCC Cell Sorting Facility: Safety Practices and Procedures
3. https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019