2018年四月， Nat Biotechnol.在线发表了青年科学家Adey教授的最新研究成果，当月NIH主任Francis Collins教授随即在其博客中给予盛赞[1]。
“实现单细胞水平的有效数据分析一直是众多生物研究者们的追求之一。此前由于单细胞分析的成本过于高昂，研究者仅能使用有限的经费完成少数细胞种类的检测分析；再加上现有的基因分析技术无法与单个细胞的表观遗传标记方法有效兼容，这让单细胞基因图谱分析始终无法真正发挥作用。
如今，Adey教授的团队将两种DNA标记物巧妙地标记到同一个细胞核上，以此实现了单个细胞的全基因表观遗传标记的高通量快速分析。借助于这项技术，我们可以将单个细胞的处理与分析成本降至原先的1%，使得单细胞基因组分析可以真正发挥出其不可思议的能力，让我们的研究愈发深刻。”




Adey教授于2014年获得博士学位，如今已荣获美国人类基因组学会（ASHG）颁发的青年成就奖。如此年轻的研究者，究竟是什么样的研究成果能够被Francis Collins主任大加赞赏？ Adey教授又是如何在如此短暂的科研时间内保持高效的研究产出的呢？让我们一起来听听Adey教授本人的有趣解说~


单细胞组合索引分选

单细胞测序技术已被证实对于异质性生物样本（如神经样本和肿瘤组织样本）的研究与理解具有不可估量的价值。 “细胞是具有高度可塑性的”，来自Portland市Oregon Health and Science University的Andrew Adey教授解释到，“就像肿瘤中的细胞一样，原本处于一种表观状态。但是当你使用某种药物处理之后，它们就会转变为另一种状态。我们感兴趣的是找到控制细胞处于不同特定类型状态的机制到底是什么，如何通过这种机制将细胞锁定在发育分化的某一特定阶段，或者推动细胞进入下一个发育阶段，以及细胞对于药物产生抗药性的根本原因。”
为厘清上述疑问， Adey博士的实验室为此设计了一种全新的测序流程方法学“单细胞组合索引分选（single-cell combinatorial indexing, SCI）”，SCI用于简单快速地建立高通量、可接受分析数量的单细胞多样性文库，同时无需额外的特殊仪器的协助。我们所需的仅仅只是一台细胞分选仪，在我们实验室里，Sony SH800S便是这样的实验神器，所有操作流程全部围绕在分选仪上展开即可。



Fig. 1 多轮编码标记分选流程。尽管未实行单细胞分选，每个细胞仍可被单独鉴定出来[2]。

尽管设计SCI的目的是为了分析单细胞多样性， 然而Adey教授的实验室却从未使用微孔板分选单个细胞。相反他们通过在细胞内标记特定DNA序列作为编码信号，使用Sony SH800S流式分选仪将细胞分选至微孔板。图1展示了具体的标记分选工作流程。
“当完成编码的细胞核被分选至孔板内后，我们可以在此基础上继续添加二级编码，以此直接获得具体的高通量的单细胞信息而不需要再对细胞进行任何操作。在此之前单个PCR孔只能建立单个细胞文库，然而通过这种方法我们可以实现在单个PCR孔中获得成千上万的单细胞文库，可以显著降低建库成本，提高实验通量。”


Fig. 2 将两种不同的DNA遗传编码先后标记到细胞核上，通过对I型DNase超敏感位点（DHS）关联区域进行ATAC测序，Adey团队实现了单个细胞核的染色质可接近性精确检测，能够使多达近两万个细胞的同时检测和亚群聚类成为可能[3]。

Adey课题组已证实SCI方法可以应用在研究表观多样性的领域中，如染色体可接近性和DNA甲基化。“我们的目的在于探索基因调控和细胞种类多样性如何实现并维持，以及不同细胞种类的可塑性与动态分化性质。”他解释道，“如果细胞在经受药物处理之后其分化或者表观状实现可追溯，那么我们就可以精确绘制出一张动态顺序渐变的细胞发育谱图，并将其中的显著性事件标记出来。上述概念最终可被应用到生物领域的众多不同方向。我们实验室的一半工作是围绕肿瘤研究展开的，另一半则是集中在神经科学方向。因此在这两个方向上，单细胞组学——即在单细胞水平探索细胞基因组学、表观基因组学以及转录组学内容，将会发挥出极大的价值。”




SCI屏障突破——细胞核分选


Fig.3 FANS单细胞核分选策略。Human or mouse样本细胞经SDS处理耗竭核小体后，进行细胞核分选用于sci-MET文库建立，最后使用Illumina NextSeq平台进行测序工作[4]。

SCI方法的核心在于流式分选细胞核 (fluorescence assisted nuclei sorting, FANS)，即通过使用DAPI染料标记DNA核酸实现细胞核的分离收集。课题组在Sony SH800S流式分选仪的帮助下，成功将之前SCI方法中的屏障逐个突破。“我们做了大量的分子实验来获取核酸编码，确保其可以正确连接到特定序列分子上。” Adey教授解释道，“在以往的实验中，当我们操作酶催化反应时细胞核仍是完整结构。为了收集广泛的基因组信息，我们需要排除核小体（nucleosomes）。但如果你确定要这么做的话，DNA就会转变成与弹簧类似的螺旋结构并将细胞核撑破，所以流式分选实验只能收集到无用的碎片！当我们在SH800上看到大量的碎片信息时，我们确信上游实验出了问题。之后我们便优化了实验流程和细胞核处理方法，圈出碎片结构，最终找到完整的单个细胞核并将编码标记的目标群体分选收集出来。”


Fig. 4 通过两次标记细胞核，并使用SDS进行核小体耗竭，SCI-seq方法能够依据单次序列读长进行单细胞基因表达图谱鉴定，并在此基础上计算CNV calling，实现tumor breakpoint分析[2]。

第二个挑战在于细胞核具有黏性，极易形成聚团结构。“分选单个细胞核事件是其中的关键之处，” Adey教授说道，“因为黏粘体会使得标记编码错位，导致分选结果混乱。这在原代肿瘤样本中更加突出，因为肿瘤细胞普遍具有多倍体细胞核。因此我们非常渴望有一种实验方法，可以将单倍体细胞、双倍体细胞和肿瘤细胞识别区分。幸运地是，在Sony SH800分选仪上我们成功地优化了相关的分选条件，并已证明上述方法学具有优异的分辨率和高通量，通过DAPI荧光和散射光信号可以高效地将单倍体细胞核分选出来。”


Fig. 5 异质性细胞群中的单细胞甲基化聚类分析。结合SCI-MET单细胞索引方法，对单细胞全基因组进行WGBS检测，研究者可以实现多种细胞类型的高通量低成本检测鉴别[4]。


实验室环境下的直观式细胞分选

当初Adey教授刚加入OHSU时，隔壁实验室的研究同事向他推荐了SH800分选仪。“同事的实验室一个月仅仅只做有限的几次分选”，Adey博士笑道，“现在我们几乎每天都在分选！”相比于其他品牌的流式分选仪，Adey博士尤其满意SH800对于细胞核的分选能力。“从那开始，单个细胞核的分选极为顺利，对此我们相当满意，所以我们立即采购了一台新的SH800分选仪。在新机器上，针对高通量分选实验，我们重新优化了DAPI染色的细胞核的分选条件，所以我们非常期待它的分选结果。”



SH800分选仪的另一个优点是简单直观且易于上手操作的分选流程。“由于实验室成员均有自己独立的课题研究，为此他们需要掌握独立的仪器操作。当新同事加入Lab，会有老伙计指导他们如何操作仪器，并于次日学会独立开展分选实验，这太不可思议了！回想当初我开始学习分选的时候，对于流式分选我总是信心不足。简单易学的操作培训对于我们来说实在太重要了！”



Adey教授同时也很赞赏SH800的可更换式微流控芯片。“我们有很多研究项目需要分别研究human和mouse样本，”他解释道。“如果我们在human样本的分选过程中出现了mouse样本，那将是一个非常糟糕的问题。SH800使用可更换式的分选管路，可以使我们在实验中避免另一种类的细胞群体造成污染。”
对Adey教授来说，能在自己的实验室中拥有一台分选仪是再好不过的惊喜了。“我们仍然信任学校的仪器平台，但对我们来说分选实验需要分阶段进行，其中往往会有多达4 h的样本处理间隔。这在预约仪器平台的分选仪时常常变得极为困难，因为总会发生预约冲突的事件。比如临床样本会在中午送到，虽然听起来不算晚，但接下来的样本处理工作会耗费大量时间，加上分选样本量十分庞大，每次的实验参数设置也不相同，这就导致了仪器平台的分选仪很难满足我们的需求。一台真正好用的分选仪，是能够像PCR仪一样可以快速上手且简单易用，你只需按SOP提示进行操作即可。”




结语

自动化的光路和液流校准功能，流动池与喷嘴一体化的分选芯片，全部可更换式的样本管路，再加上高度准确的多孔板单细胞分选能力，这些正是Adey教授将奇思妙想转化为实际研究成果的重要转换器。相信在接下来的研究课题中，Sony SH800S自动化流式分选仪将继续为Adey教授提供强劲有力的实验支持，期待更为精彩的研究发现！


Sorting Made Simple™: SH800S可以完美契合Adey教授的多流程步骤课题研究


Reference
1. https://directorsblog.nih.gov/2018/04/16/dna-barcodes-make-for-better-single-cell-analysis/
2. Vitak SA, Torkenczy KA, Rosenkrantz JL, et al. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing. Nat Methods. 2017;14:302-308.
3. Cusanovich DA, Daza R, Adey A, et al. Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science. 2015;348:910-914.
4. Mulqueen RM, Pokholok D, Norberg SJ, et al. Highly scalable generation of DNA methylation profiles in single cells. Nat Biotechnol. 2018;36:428-431.