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含毒单细胞测序助力重型登革热的发病机制研究
人阅读 发布时间：2019-09-28 22:58
导读
登革病毒（DENV）是全球健康的主要威胁之一，据统计，每年有4亿人感染登革热，其中有5％至20％在4到7天内发展成重型登革热（SD），临床表现为出血、休克、器官衰竭，甚至死亡。早期支持性治疗可降低患者死亡率，但是目前还没有方法可以预测哪些患者会发展为SD。近些年科学家开始研究SD病人早期血液中的生物标志物，他们重点关注两种实验技术：（1）流式细胞术检测的固定血液群体；（2）从血液或PBMCs中提取大量RNA进行基因检测。这些研究大都确定了与SD相关的基因，但不在SD发病之前，因此不能作为后期病变的预测生物标志物。从技术角度看，流式细胞仪适合检测已知标志物、分群比较明显的细胞群，但不太适合筛选复合物，检测细胞类型、亚型和免疫反应的动态变化，难以确定含DENV RNA的PBMC。大量细胞的转录组测定可以筛选数以千计的基因，但其分辨率有限，因为不能获取组织的异质性，不同细胞群的平均信号会因多种细胞类型和不同激活状态被混淆。
该文献中，研究者结合FACS（荧光激活的细胞分选）与viscRNA-Seq（含病毒的单细胞转录组测序）鉴定患者血液中含DENV RNA的免疫细胞，并在患者发展成SD前预测分子信号。
FACS-assisted viscRNA-Seq workflow
液样本来自4名健康对照组和6名DENV感染患者，2名患者病情较轻，4名患者后面进展成SD。患者的疾病严重程度根据2009年世界卫生组织标准进行了分类。获取10名受试者的外周血单个核细胞（PBMC）、全血和血清样品，并通过qRT-PCR和血清学方法确认是DENV感染而非其他虫媒感染。
用PBS将全血按照1:1稀释，加入含15ml Ficoll的SepMate管中，1,200g离心10min，然后将PBMC层吸入新的管中并用PBS洗涤，250xg离心10min后，用冻存液重悬，进行冻存。
a.将细胞在37℃水浴中复苏，加入9ml温热的培养基，300g离心8min，弃上清液加入2ml培养基重悬。用同样的条件离心后弃上清液，将细胞重悬于含1％BSA 100ul 的PBS。加入5ul Fc 受体封闭液，室温孵育15min。加入300ul PBS，补充总体积到405ul。将细胞悬浮液分成3或4个等份（100ul/份），每份加入10-30ul抗体混合物（3ul/抗体），冰上孵育45min，然后加入1ml PBS。加入1ul SYTOX Blue染死细胞，37℃室温孵育5min。用35-40 um过滤器把细胞过滤到流式管中，再加入1mlPBS补充总体积到2ml。
b.准备一个带裂解液的384孔（裂解液体积0.5ul），裂解板含有多腺苷酸化mRNA的捕获序列和DENV特异性捕获序列，使用Sony SH800细胞分选仪把“a”中的细胞悬液分选到该384孔板中，分选时使用100um的芯片和“Targeted”模式校准，然后进行逆转录，产生和扩增cDNA。
c.部分板子通过Quant-iT™ PicoGreen™dsDNA Assay Kit进行cDNA定量，并通过液体处理器自动标准化至0.4ng/ul，使用Nextera XT试剂盒制备测序文库和Ampure XP磁珠纯化DNA。
d.进行测序，同时定量单细胞病毒丰度和宿主转录组的变化。
Sony SH800配备专门独特优化的"Targeted"液流模式，能够进一步提升分选液滴偏转精度，使得利用96孔板和384孔板进行单细胞孔板分选变得轻而易举；同时Targeted模式也适合于对较大或较脆弱细胞进行分选，可以更好地保证分得细胞的活性。
每个单细胞提供的信息包括：细胞类型，免疫激活状态，感染状态和病毒群体基因组学
Sorting
All Events: 调整FSC和SSC电压，选择PBMC细胞群体
A: 去黏连体
C: 死活染色或非目的细胞阴选
G: 目的细胞共表达marker阳选
K: 进一步设门，分析T、B、NK、NKT、DC和单核细胞群体
设定分选条件、进行各种细胞群的高通量单细胞分选
Results
1）多种IFN应答基因，特别是NaiveB细胞中的MX2和CD14+CD16+单核细胞中的CD163在SD病人前期以细胞特异性方式上调。
2）两名SD患者中含vRNA的细胞绝大多数都是Naive IgM B，这种细胞高表达CD69和CXCR4受体和各种抗病毒基因，其次是单核细胞。
3）不含vRNA的B细胞还表现出免疫激活，另外来自两名患者的IgG1浆母细胞表现出克隆性扩张。
4）最小等位基因频率(MAF)的解读揭示了病毒群体的基因多样性。
Fig.3.
Fig.4.
Significance
•描述了病人发展成为SD之前的成千上万单个血细胞的病毒RNA情况和转录组的概况；
•发现了细胞特异性免疫激活和可能具备预测性的生物标志物；
•确定了和病毒相关的最新特定细胞群，特别是Naive B细胞和单核细胞；
•探讨了不含vRNA免疫细胞的免疫激活、克隆性和适应性免疫调节的体内变化，以及病毒基因组学。
多种方法学的研究可以提前了解病毒感染的发病机制，绘制被感染细胞的基因图谱，促进预测发展。
亮点解读
该研究的技术难点是难以确定含DENV RNA的PBMC和精准测定含DENV RNA 的PBMC 分子信息，SH800流式分选仪支持PBMC多色方案分析，可以进行384孔板的高通量单细胞分选，保证了细胞的纯度和活性，为RNA测序实验提供了宝贵的样本，最后结合测序结果确定了含DENV RNA的PBMC和预测患者发展成SD前的分子信号，流式分选是本次研究的最关键性技术，为后续实验提供了基础。
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全自动流式分选仪SH800S
创新微流体芯片液流系统
全自动化校准，免除人为调试
样本全部流路均易于更换
1分钟插拔式更换，可实现样本之间零交叉残留
可配备多达4根激光(405/488/561/638)
覆盖所有常见荧光染料
3种规格芯片(70um/100um/130um)
充分满足研究者对不同大小细胞的分选需求
单细胞分选及索引分选功能
便于对目标单个细胞追踪溯源
Reference
1.Virus-inclusive single-cell RNA sequencing reveals the molecular signature of progression to severe dengue[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(52): E12363-E12369.
登革病毒（DENV）是全球健康的主要威胁之一，据统计，每年有4亿人感染登革热，其中有5％至20％在4到7天内发展成重型登革热（SD），临床表现为出血、休克、器官衰竭，甚至死亡。早期支持性治疗可降低患者死亡率，但是目前还没有方法可以预测哪些患者会发展为SD。近些年科学家开始研究SD病人早期血液中的生物标志物，他们重点关注两种实验技术：（1）流式细胞术检测的固定血液群体；（2）从血液或PBMCs中提取大量RNA进行基因检测。这些研究大都确定了与SD相关的基因，但不在SD发病之前，因此不能作为后期病变的预测生物标志物。从技术角度看，流式细胞仪适合检测已知标志物、分群比较明显的细胞群，但不太适合筛选复合物，检测细胞类型、亚型和免疫反应的动态变化，难以确定含DENV RNA的PBMC。大量细胞的转录组测定可以筛选数以千计的基因，但其分辨率有限，因为不能获取组织的异质性，不同细胞群的平均信号会因多种细胞类型和不同激活状态被混淆。
该文献中，研究者结合FACS（荧光激活的细胞分选）与viscRNA-Seq（含病毒的单细胞转录组测序）鉴定患者血液中含DENV RNA的免疫细胞，并在患者发展成SD前预测分子信号。
FACS-assisted viscRNA-Seq workflow
液样本来自4名健康对照组和6名DENV感染患者，2名患者病情较轻，4名患者后面进展成SD。患者的疾病严重程度根据2009年世界卫生组织标准进行了分类。获取10名受试者的外周血单个核细胞（PBMC）、全血和血清样品，并通过qRT-PCR和血清学方法确认是DENV感染而非其他虫媒感染。
用PBS将全血按照1:1稀释，加入含15ml Ficoll的SepMate管中，1,200g离心10min，然后将PBMC层吸入新的管中并用PBS洗涤，250xg离心10min后，用冻存液重悬，进行冻存。
a.将细胞在37℃水浴中复苏，加入9ml温热的培养基，300g离心8min，弃上清液加入2ml培养基重悬。用同样的条件离心后弃上清液，将细胞重悬于含1％BSA 100ul 的PBS。加入5ul Fc 受体封闭液，室温孵育15min。加入300ul PBS，补充总体积到405ul。将细胞悬浮液分成3或4个等份（100ul/份），每份加入10-30ul抗体混合物（3ul/抗体），冰上孵育45min，然后加入1ml PBS。加入1ul SYTOX Blue染死细胞，37℃室温孵育5min。用35-40 um过滤器把细胞过滤到流式管中，再加入1mlPBS补充总体积到2ml。
b.准备一个带裂解液的384孔（裂解液体积0.5ul），裂解板含有多腺苷酸化mRNA的捕获序列和DENV特异性捕获序列，使用Sony SH800细胞分选仪把“a”中的细胞悬液分选到该384孔板中，分选时使用100um的芯片和“Targeted”模式校准，然后进行逆转录，产生和扩增cDNA。
c.部分板子通过Quant-iT™ PicoGreen™dsDNA Assay Kit进行cDNA定量，并通过液体处理器自动标准化至0.4ng/ul，使用Nextera XT试剂盒制备测序文库和Ampure XP磁珠纯化DNA。
d.进行测序，同时定量单细胞病毒丰度和宿主转录组的变化。
Sony SH800配备专门独特优化的"Targeted"液流模式，能够进一步提升分选液滴偏转精度，使得利用96孔板和384孔板进行单细胞孔板分选变得轻而易举；同时Targeted模式也适合于对较大或较脆弱细胞进行分选，可以更好地保证分得细胞的活性。
每个单细胞提供的信息包括：细胞类型，免疫激活状态，感染状态和病毒群体基因组学
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C: 死活染色或非目的细胞阴选
G: 目的细胞共表达marker阳选
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Results
1）多种IFN应答基因，特别是NaiveB细胞中的MX2和CD14+CD16+单核细胞中的CD163在SD病人前期以细胞特异性方式上调。
2）两名SD患者中含vRNA的细胞绝大多数都是Naive IgM B，这种细胞高表达CD69和CXCR4受体和各种抗病毒基因，其次是单核细胞。
3）不含vRNA的B细胞还表现出免疫激活，另外来自两名患者的IgG1浆母细胞表现出克隆性扩张。
4）最小等位基因频率(MAF)的解读揭示了病毒群体的基因多样性。
Fig.3.
Fig.4.
Significance
•描述了病人发展成为SD之前的成千上万单个血细胞的病毒RNA情况和转录组的概况；
•发现了细胞特异性免疫激活和可能具备预测性的生物标志物；
•确定了和病毒相关的最新特定细胞群，特别是Naive B细胞和单核细胞；
•探讨了不含vRNA免疫细胞的免疫激活、克隆性和适应性免疫调节的体内变化，以及病毒基因组学。
多种方法学的研究可以提前了解病毒感染的发病机制，绘制被感染细胞的基因图谱，促进预测发展。
亮点解读
该研究的技术难点是难以确定含DENV RNA的PBMC和精准测定含DENV RNA 的PBMC 分子信息，SH800流式分选仪支持PBMC多色方案分析，可以进行384孔板的高通量单细胞分选，保证了细胞的纯度和活性，为RNA测序实验提供了宝贵的样本，最后结合测序结果确定了含DENV RNA的PBMC和预测患者发展成SD前的分子信号，流式分选是本次研究的最关键性技术，为后续实验提供了基础。
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Reference
1.Virus-inclusive single-cell RNA sequencing reveals the molecular signature of progression to severe dengue[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(52): E12363-E12369.
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