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大通量且高效的TCR特异性筛选——临床治疗中肿瘤病人体内抗原表位的鉴定新方法

发布时间:2019-03-13 17:31 |  点击次数:

 

背景导读

  

       T细胞在感染、自体免疫和癌症等细胞治疗领域具有极其重要的功能作用,但遗憾的是由于TCR、HLA分子以及抗原表位的序列多样性,以及TCR测序手段的发展制约,目前我们对体内TCR clone的抗原表位识别仍然所知甚少。这使得科学家们在探究治疗癌症、自体免疫和感染疾病的病例时,难以快速确认体内相应的抗原表位,迅速制定有效的治疗方案。

        今年年初Cell杂志在线发表了一篇文章,来自斯坦福大学医学院的研究者们向我们展示了一种新颖的酵母表面展示技术,结合single cell TCR analysis方法,建立pHLA-A*02:01多肽文库为TCR clone识别抗原表位提供了一种高通量的筛选可能。

  

实验方案

  

       文章作者拟设计一种大容量的多肽合成文库,结合单细胞深度测序技术,筛选病人体内的潜在抗原表位,为临床细胞疗法的TCR配体识别提供一种快速有效的鉴定方法。

       研究者使用酵母表面展示技术模拟体内抗原表位识别的真实免疫反应环境,设计抗原合成文库;同时对肿瘤患者的TILs测序,使用来自病人体内的TCR受体进行抗原表位的筛选工作。接着依据筛选到的抗原表位,结合human proteome数据库分析预测潜在的自体抗原和突变抗原,并用T细胞免疫反应功能实验进行验证。

 

  

多肽文库的建立与功能验证

   

图1. 多肽文库合成示意

       研究者使用HLA-A型蛋白为抗原呈递分子,采用酵母细胞为抗原展示平台(图1)。文章以已知的天然DMF5-TCR分子作为benchmark,使用多聚DMF5-TCR耦联磁珠筛选yeast菌株,验证pHLA-A*02:01合成文库的抗原表位呈递可行性(图2)。

图2. DMF5 TCR clone流式分析结果

     作者首先使用NKI TCR clones筛选pHLA多肽文库,筛选出127 peptides。同时免疫功能实验显示,所有抗原多肽均可诱导NKI2-TCR+淋巴细胞分泌IFN-γ因子。有趣的是诱导效果最好的多肽序列ALDSRSEHFM和CDK4蛋白抗原ALDPHSGHFV表现出高度的序列一致性,证实CDK4蛋白确是NKI2-TCR分子的特异性识别配体分子(图3)。

图3. NKI TCR clones筛选结果

  

TILs TCR抗原表位筛选

  

图4. 肿瘤病人TILs TCR测序

       研究者筛选了两名HLA-A*02显性纯合子的结直肠腺癌患者(图4),从中筛选出20 TCR candidates进行多肽文库筛选,结果显示仅有4 TCR clones 可成功识别pHLA-A*02:01复合体(图5)。

       接着作者测试了交叉反应,结果显示TCR 1A, 3B所识别的抗原表位高度保守,与之相反的是TCR 2A, 4B分子可识别多种抗原多肽。故而,对于适应性细胞疗法而言,pHLA-A*02:01多肽文库可有效筛选并表征TCR clone的交叉反应能力,在控制自体免疫反应方面可发挥出重要作用。

图5. TILs TCR抗原表位筛选

  

人源蛋白组学抗原表位预测与验证

  

       研究者根据上述文库筛选数据,分析人源蛋白组数据,预测多种抗原多肽序列,并使用免疫反应实验验证筛选结果是否符合预期。作者将T2细胞转染表达HLA-A*02:01-peptide复合体,与TCR clone+/SKW-3 CD8+ T细胞系共培养,CD69激活实验检测结果显示经TCR 1A clone筛选获得的合成peptides可同时刺激4 TCR clones,并表现出剂量依赖性(图6)。

图6. 合成多肽与预测多肽的免疫反应验证结果

  

结论与亮点

  

1. pHLA-A*02:01抗原多肽文库可用于鉴定TCR特异性识别的未知内源性或模拟抗原表位,也可以用于TCR抗原识别种类鉴定。

2. 不同于现有的其他方法,pHLA-A*02:01多肽文库具有极大的序列多样性,同时使用酵母展示技术模拟体内抗原呈递的真实免疫反应,为TCR clone的抗原识别提供了更加客观的筛选手段。

3. 本篇文章在TCR clone+ SKW-3 cell line构建实验中,使用了Sony SH800S全自动智能化流式分选仪来进行阳性转染细胞的分选富集,为最终的抗原表位peptides的免疫反应功能验证实验提供了重要的细胞系基础,确认了pHLA-A*02:01多肽文库的TCR抗原表位的高通量筛选可行性,使得整篇论文的研究顺利走向了最终的胜利!

参考文献

Gee et al., Antigen Identification for Orphan T Cell Receptors Expressed on Tumor-Infiltrating Lymphocytes, Cell (2018), https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.11.043

Strønen, E. et al., (2016). Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires. Science 352, 1337–1341.