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脊髓损伤患者的福音?——《Nature Medicine》揭示脊髓星形胶质细胞的命运可塑性

发布时间:2019-03-13 17:28 |  点击次数:

导读:

脊髓损伤(SCI)导致永久性运动和感觉神经功能障碍(严重情况下导致高位截瘫),在此过程中脊髓中分布最广的星形胶质细胞经历从Naïve到Reactive再到Scar-forming的三种阶段的表型变化,最终在脊髓上形成疤痕(Scar) ,此过程被称为Reactive Astrogliosis(反应性星形胶质细胞增生症),阻碍了中枢神经元轴突再生进而导致了功能障碍。

      长期以来人们认为这个过程是单向不可逆的,而2017年《Nature Medicine》报道的一项来自九州大学的研究打破了这种认知,研究表明脊髓损伤引起的星形胶质细胞增生症并非不可逆,通过调节细胞环境因素可以逆转星形胶质细胞的命运,为治疗中枢神经损伤开辟了新思路。

如何准确区分三种不同阶段的星形胶质细胞?

由于长期以来缺乏特异性区分三类星形胶质细胞的标记物,因此对于脊髓损伤后细胞和分子机制的研究也不甚清楚。通常人们用GFAP(Glial fibrillary acidic protein)作为星形胶质细胞的Marker,但RAs和SAs也同样高表达GFAP,形态学和免疫组化的方法就成了区分三类星形胶质细胞的最常用手段,但这样既不够客观也难以定量。为了精确定义三类细胞,本文作者利用了激光显微切割(Laser Microdissection, LMD)获取脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)模型小鼠不同时间的星形胶质细胞,进而结合RNA表达谱测序的方法,鉴定出RAs和SAs特异性的标记物。

1.三种星形胶质细胞特异性Marker的鉴定方案

2.RAs和SAs的特异性Marker

脊髓损伤斑痕的形成是细胞自发性的(cell-autonomous) 还是非细胞自发性的(non-cell-autonomous)?

有了特异性marker区分三种星形胶质细胞这一手段,作者进一步研究脊髓损伤斑痕的形成过程是细胞自发性的还是环境依赖性的。通过将体外培养的带有GFP示踪的星形细胞分别移植到健康小鼠和脊髓损伤模型小鼠的脊髓部位,免疫组化染色发现移植细胞在健康和脊髓受损模型小鼠中均呈现与供体小鼠自身的星形细胞一致的形态学特征,进一步通过激光显微切割(LMD)及RNA-seq ,发现在基因表达谱上移植细胞也与供体细胞表达特征一致。这提示脊髓斑痕形成过程是非细胞自发性的,正常小鼠的星形胶质细胞的命运具有受环境影响的可塑性。

3.激光显微切割辅助的RNA-seq手段发现RA细胞具有环境依赖的可塑性

(a)NAs细胞移植及选择性分离实验方案

(b,c,d)不同处理条件下RAs和SAs标志物基因的时序表达特征

星形胶质细胞命运可塑性是否在脊髓损伤状态下也依然存在?

为研究脊髓损伤状态下星形胶质细胞的可塑性是否依然存在,作者利用带有Nes-GFP报告基因的小鼠作为对象,在经过脊髓损伤(SCI)造模之后,利用流式细胞技术分选Nes-GFP阳性细胞(即RAs)并分别移植到野生型健康小鼠和脊髓损伤模型小鼠中,同样利用免疫组化以及LMD和RNA-seq手段对移植细胞进行鉴定。结果表明当把脊髓损伤处的反应性星形胶质细胞(RA)移植回健康的脊髓,RA可以逆变回naïve状态,表明小鼠脊髓损伤部位的星形胶质细胞仍旧保留命运可塑性。

4.RAs细胞移植及选择性分离实验方案

5. 免疫组化显示移植到脊髓损伤小鼠的RA形成斑痕,而移植到健康小鼠的RA却没有。

什么因素影响着性星形胶质细胞的命运?

通过对不同处理组RA细胞的RNA-seq结果分析发现,Ⅰ型胶原蛋白在N-cadherin介导的RA细胞黏附起着关键作用,免疫组化结果证实了这一结论。

6. RNA表达谱和免疫组化结果提示ColⅠ基因在RAs的黏附中起着重要作用

是否可以通过改变细胞环境来改善甚至治疗脊髓损伤?

作者通过Integrin抗体阻断RA与Ⅰ型胶原的相互作用后,通过免疫组化和神经生长等功能实验发现可以一定水平上在表型和功能方面修复脊髓损伤。机制研究表明受损脊髓中高表达的Ⅰ型胶原通过RA中的整联蛋白(Integrin)-N-cadherin信号通路诱导了疤痕形成,药物阻断RA与Ⅰ型胶原的相互作用可以阻止疤痕形成,从而改善神经元轴突生长和神经功能恢复。

7. 阻断RAs与ColⅠ的相互作用可以阻止斑痕形成

通过人为调节细胞环境可以阻止脊髓斑痕的形成,为治疗中枢神经损伤提供了潜在靶点。至此,作者完成了原理验证(Proof of Principle)工作。

8. 工作模型

   

亮点解读:

1. 中枢神经系统的可塑性一直是备受关注的话题。长久以来人们都认为中枢神经系统的受损大都是不可逆的,而本研究基于小鼠模型剖析发现脊髓损伤引起的星形胶质细胞增生症并非不可逆,细胞的环境因素起到了至关重要的诱导作用,认为更改细胞环境可以逆转星形胶质细胞的命运,从而为治疗中枢神经损伤开辟了新的思路

2. 本研究中最关键的体内实验证据部分是基于将脊髓受损模型小鼠的RA细胞分离并移植到供体小鼠而得到的,而这其中能否分离到活性良好的RA细胞是实验成功的关键。本文的RA细胞的分离工作全部是在Sony SH800S智能全自动流式细胞分选仪上实现的,表明了SH800S的微流体芯片管路设计对于星形胶质细胞等神经细胞样本活性的良好维持。

   

参考文献:

1. Hara Masamitsu, et al. Interaction of reactive astrocytes with type I collagen induces astrocytic scar formation through the integrin-N-cadherin pathway after spinal cord injury. Nature Medicine, 23 (2017), pp. 818-828

2. Seiji Okada, et al. Astrocyte reactivity and astrogliosis after spinal cord injury. Neuroscience Research,126 (2018), pp.39-43

 

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