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光谱流式应用(一)|外周血自发荧光

发布时间:2018-10-31 17:05 |  点击次数:

虽然荧光染料和荧光蛋白已经在生命科学研究中应用非常广泛。但是在很多情况下,自发荧光(背景荧光)对实验结果的准确性带来了极大的挑战。

PBMC 中的自发荧光现象

下图显示了在检测人血中嗜酸性粒细胞(Eos)自发荧光对特异染料荧光的干扰:
 

图中红圈标记的 Eos 在 PE,PacBlue,BV510 荧光下都能检测到阳性信号,这些阳性信号会极大的干扰阳性数据的计算,导致结果误判。

自发荧光来源

文献报道,哺乳动物细胞中的自发荧光来源复杂,例如黄素 Flavins,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD,脂褐素 lipofuscin 等等;除了自然条件下的自发荧光,处理细胞的试剂,例如细胞固定和浸润等试剂也能改变自发荧光。这些不同自发荧光物质其激发波长和发射波长有所差别,混杂在一起对各个波长荧光检测都有影响(见下图)。


传统流式的局限

在传统流式采用滤光片分光检测技术下,自发荧光往往通过补偿矩阵方式进行扣减。但是自发荧光通常谱型较宽,与绝大多数染料荧光都有光谱重叠,因此很难通过荧光补偿的方式将自发荧光从染料荧光中分离出来,从而对染料荧光信号检测造成干扰。曾有文献报道,如果能获得更为全面的荧光光谱信息,系统通过光谱和光谱之间特征性差别可以实现染料荧光和自发荧光的分离(见下图)。

 

光谱流式原理

目前传统流式对自发荧光干扰往往束手无策,没有很好的解决办法。索尼作为一家光电科技领域的先驱者,成功缔造了全球首款全光谱流式细胞仪,舍弃仅能检测狭窄范围信号的传统滤光片,首次采用棱镜模组分光和专利技术 32 联排 PMT,实现 420-800nm 波长范围内光谱荧光信号检测(见下图)。该技术的实现也突破了传统流式的诸多限制,标志着光谱流式时代的到来!


如何破除自发荧光干扰

索尼全光谱流式细胞仪实现对细胞自发荧光从 420nm-800nm 波长范围光谱扫描,软件可以帮助我们快速的找出并计算得到不同的自发荧光的光谱线。系统将这些自发荧光与染料荧光同时分析;利用自发荧光光谱与染料荧光光谱的差异,结合统计学算法,完成了对染料荧光和自发荧光的拆分。


目前索尼全光谱流式统一采用加权最小二乘法 WLSM 解析检测数据,该算法经过上百年的演算和发展,广泛而成熟的应用在人文社科各个领域;在生命科学领域,大家较为熟知的激光共聚焦等荧光扫描成像系统都长期使用该算法。通过先进的光谱流式扫描技术,结合成熟的统计学算法,实现了把 Eos 自发荧光信号从 PE,PacBlue,BV510 荧光信息中分离出来,从而获得可靠和真实的统计结果(见下图)。


除了我们以上举例的 PBMC 样本外还有哪些自发荧光常常困扰着我们的实验呢?

关于索尼生命科学 SONY Biotechnology

全光谱流式系统是世界电子科技领导厂商索尼集团公司首次面向全球研发的生命科学设备。索尼公司生命科学业务部前身为成立于 1995 年的美国伊利诺伊州立大学创新研发中心的 iCyt Mission Technology,2010 年被索尼集团全资收购成为独立子公司,也成为索尼集团大力投资生命科学领域、并应用其光学和电子产业的技术优势助力生命科学研究,实现再一次创新式发展的里程碑。

索尼生命科学产品融合了索尼公司的在光学、电子和图像处理等领域革命性的创新技术,旗下的产品包括全全光谱流式分析仪、自动流式分选仪及细胞运动成像系统等均受到用户广泛好评,全球有超过 1000 家科研机构及科技公司正在使用索尼生命科学的产品。

参考文献:

1. shilova ON, Shilov ES, Deyev SM. The effect of trypan blue treatment on autofluorescence of fixed cells. Cytometry A. 2017 Aug 30. doi:10.1002/cyto.a.23199.

2. John P. Nolan and Danilo Condello.Spectral Flow Cytometry. Curr Protoc Cytom. 2013 January ; CHAPTER: Unit1.27. doi:10.1002/0471142956.cy0127s63.



愿我们的努力为您的实验增添一份助力!

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