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分选那些事|样品制备知多少?

发布时间:2018-08-06 15:42 |  点击次数:

通常,组织或者培养的细胞不能直接用于流式分选实验,我们需要对不同来源的细胞经过一系列处理制备成理想的实验样本,在此需要注意哪些内容?

理想的样品制备: 获得高活性的单细胞悬液。

   

样品制备中需要考虑的因素包括:

 

1.黏连细胞或者细胞团不仅容易堵塞上样管,液流不稳定;而且这些黏连和团块信号会对流式细胞仪做出分选决定造成困扰,最终导致分选纯度,回收率下降。如果不想丢弃含有大量细胞的细胞团块,建议在操作过程每一步都使用30-100um尼龙滤网过滤细胞;在收集管规格上,相比锥底离心管,本文建议使用大直径(17mm)的圆底离心管;相比聚苯乙烯(Polystyrene)材质的离心管,聚丙烯(Polypropylene)材质的离心管更加适合流式细胞分选使用。在制备过程中,不要让离心后的细胞团块静置太长时间,应该尽快弃掉上清,重悬细胞。

 

2.细胞碎片不仅在分选过程中会大量占用信号处理资源,增加分选丢弃率,造成分选效率下降;而且随着大量细胞碎片在进样管路或者喷嘴位置累计会造成进样管路堵塞,液流不稳定,导致分选活性和回收率下降。虽然在仪器设置上可以通过设置阈值(Threshold)有效过滤碎片信号,但是细胞碎片依然存在分选液滴中,对分选细胞造成干扰,导致回收率和活性下降。细胞碎片往往是由于细胞状态较差,死亡细胞较多或者在处理过程中对细胞损伤造成;通常,在上机分选前建议使用胎盘蓝染色或者PI或者7-AAD染色检测细胞活性,上机前维持样品高比例的活细胞是分选后细胞质量的保障;同时,在制备过程中注意避免反复吹打,尽量减少对细胞的损伤。

   

3.细胞活性往往是细胞分选中最感兴趣的指标。要想获得高活性的单细胞悬液往往需要对不同类型细胞分析,采用正确的处理方法,尽量减少细胞团块,碎片和死细胞。死细胞释放的DNA和细胞质,会影响活细胞功能,增加细胞黏连,同时产生大量细胞碎片,容易产生非特异吸附荧光抗体,造成假阳性信号检出。本文推荐使用细胞活性标记物PI或者7-AAD用于分选前排除样本内死细胞;前面也介绍到样品中细胞团块,黏连或者碎片等等,都会降低分选活性和回收率。通过FSC-A和FSC-H圈门排除部分黏连细胞信号;设置合适的阈值可以降低电子处理系统对碎片信号处理的负担。无论如何,分选后的细胞不可能比分选前活性更高。

 

4.DNA核酸在破坏分离组织过程中往往会被大量释放。培养液中加入EDTA(1-5mM)和DNA酶(20-200ug/mL)能够帮助大量减少细胞团块形成。

 

5.上样温度和收集温度控制对细胞活性的影响。保持低温上样(5度)和低温收集(5度)可以降低细胞新陈代谢水平,保持细胞活性,稳定荧光信号。

   

6.细胞重悬液对细胞活性也产生重要影响。相比较PBS或者PBS+BSA/FBS重悬样本上机分选,本文推荐使用HBSS或者细胞生长培养液+2%BSA/FBS,例如PRMI-1640培养液。在细胞制备和分选过程中保持4度低温。对于小鼠淋巴细胞分选建议使用培养液RPMI-1640重悬样本,但是不建议在培养液中加酚红,生物素,NADH(还原型辅酶I),FMN(核黄素);这些化合物对细胞检测会造成较强的自发荧光干扰,导致假阳性信号检出。

 

7.细胞收集液通常使用合适的培养基和PBS,培养基内通常需要添加HEPES用于维持pH,并且使用高浓度血清或者BSA(例如10%-50%),由于随着分选细胞不断进入分选管,收集液的成分会被不断稀释。一般12 x 75mm 流式管分选前如果加入1ml分选收集液,在70um喷嘴分选条件下该流式管可分选到大约3百万个液滴。如果在100um喷嘴条件下可分选到大约1百万个液滴。

   

8.悬浮细胞,例如淋巴细胞是一类非常容易获得单细胞的类型,例如正常人外周血中淋巴细胞含量约2~4 x 10E6 cells/ml;或者使用磨砂玻片分离淋巴结或者脾脏也可以获得很好的淋巴细胞。

 

9.组织和贴壁细胞相比较淋巴细胞制备会复杂一些。组织细胞通常需要使用蛋白酶和胶原酶以及适当的操作步骤实现组织分离。对于贴壁细胞能够很强黏附在培养瓶底面。虽然,使用胰酶可以较强的去处细胞对塑料底面的黏附 ,但是也可能清除一些细胞表面的蛋白标记物,导致抗体结合位点被破坏。本文推荐使用ACCUTASE细胞消化液和ACCUMAX细胞解离团块培养基可以温和的消化细胞,减少对细胞表面抗原的破坏。

 

10.细胞数量是我们每次分选前需要考虑到的重要因素,首先我们需要对获得的细胞数量有一个预期的数量。例如,预估需要分选1x10E5个细胞,系统显示平均分选效率(Efficiency)80%,建议上机前细胞量至少是预估总细胞数量的两倍,即:

即 :

   

除此之外还需要考虑到细胞制备过程中,比如离心,过滤等步骤带来的细胞损失。而且,在调整电压,阈值等参数设置,和计算补偿,对照设置中也需要耗费一定细胞数量。

 

11.分选时间由预估需要分选的细胞数量,系统分选平均效率,上样细胞浓度和上样速度决定,分选系统一般也会通过效率估算每管样品分选时间。除此之外还需要留出时间用于样品制备,补偿计算,仪器校准等;如果做GFP单色分选,预留半小时用于分选设备的校准相对稳妥。

   

12.管路无菌是分选细胞培养的关键条件,本文推荐每两周对整个仪器整个液流管路消毒灭菌,鞘液和水用0.2um滤膜过滤;分选培养液中加入50ug/ml庆大霉素 (Gentamycin)或者青霉素-链霉素(Pen-Strep)双抗,工作浓度的庆大霉素在4度环境下保存时间不超过1周。一般分选都没有使用抗生素,但是在分选稀有样本时,本文建议加入抗生素降低污染的风险。

 

13.鞘液一般使用0.01M PBS,但是某些细胞生长对PBS极为敏感需要用到一些特殊成分的鞘液,例如鞘液中加入MES,碳水化合物(葡萄糖)等;需要提前咨询流式管理员是否允许在设备上使用。

 

参考文献:   Practical Cell Sorting from University of North Carolina Core Facility. 

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