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流式解惑系列|同型对照知多少

发布时间:2018-11-16 10:31 |  点击次数:

小师妹:
师兄,我的流式又失败了。。同型对照的表达比实验组的表达还要高!嘤嘤嘤

大师兄:
首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象。所以说哦,要找到一个正确的同型对照,比你找到一个男朋友可能还要难~

小师妹:
那这到底肿么破?师兄帮帮我~~~请你吃大餐!

大师兄:
师兄哪是为了一顿饭呀~~来,我给你讲讲同型那些事儿!

 
开 ~ 讲 ~ 啦

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。

要想选择合适的同型对照,跟着我来三步走
  1. 一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体
  2. 如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。
  3. 如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的顺序应该是亚链不同--亚型不同--相同类别。

考考你,假如要检测抗 CD69-PE 的荧光信号,怎么设置它的同型对照呢?

当当当~~~揭晓答案 
☟ 

抗 CD69-PE 的同型是与抗 CD69 抗体同种属(来源于同一物种)且同类(抗 CD69-PE 中的抗体是 IgG1 类的)非特异性抗体(IgG1)与 PE 荧光素偶连的同型对照抗体(即 IgG1-PE)。检测得到的荧光信号示意图如下:
 

小师妹:
原来同型对照是这样子的,那师兄,每次实验都必须做同型对照吗?

大师兄:
那倒不是。做胞内流式,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等;或者使用不常见的标志或者特异性不高的标志的时候,可以根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性。所以如果你是做常用的表面标志或者对流式很熟悉,一般可以不用同型对照啦~

小师妹:
师兄,你「拯救」了我啊!师兄万岁!


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